2022年植物DNA和RNA提取方法 .pdf
实验一植物基因组 DNA 的提取一、实验目的掌握植物总DNA 的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改进植物总 DNA 抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类 )对 DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强复原剂(如巯基乙醇 )以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十 二 烷 基 肌 酸 钠 (sarkosyl) 、 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB) 、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS)等离子型外表活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA 得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性， 并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于 TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。三、 实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2% CTAB 抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) EDTA 8ml ，先用 70ml ddH2O 溶解 , 再定容至200ml 灭菌 , 冷却后 0.2-1% 2-巯基乙醇 400ul氯仿 -异戊醇 24：1 ：先加 96ml 氯仿，再加4ml 异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1. DNA 的提取1 2%CTAB 抽提缓冲液在65水浴中预热。2取少量叶片约1g置于研钵中，用液氮磨至粉状；3 加入 700ul 的 2%CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动；4 将磨碎液分倒入1.5 ml 的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；5置于 65的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min 轻轻摇动， 40 min 后取出；6冷却 2 min 后，加入氯仿 -异戊醇 24：1至满管，剧烈振荡23 min，使两者混合均匀；7放入离心机中10 000 rpm 离心 10 min，与此同时，将600 l 的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；8 10 000 rpm 离心 1 min 后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内， 将离心管慢慢上下摇动30 sec， 使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA 絮状物；910000 rpm 离心 1 min 后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA 沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；1060 sec后，直立离心管，加入720 l 的 75%乙醇及 80 l 5 M 的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA 块状物浮游于液体中；11放置 30 min，使 DNA 块状物的不纯物溶解；1210000 rpm 离心 1 min 后，倒掉液体， 再加入 800 l 75%的乙醇， 将 DNA 再洗30 min；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 11 页1310000 rpm 离心 30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA 自然风干或用风筒吹干；14加入 50 l 0.5 TE(含 RNase)缓冲液，使DNA 溶解，置于37恒温箱约15 h，使 RNA 消解；15置于 -20保存、备用。2. DNA 质量检测琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、注意事项 1叶片磨得越细越好。 2移液器的使用。 3由于植物细胞中含有大量的DNA 酶，因此，除在抽提液中加入EDTA 抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA 酶，使 DNA 降解。思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿 , 异丙醇 , 75%乙醇 , EDTA 2提取基因组DNA 的方法有哪些？各有何优缺点？实验二 多聚酶链式反应 ( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的通过本实验学习PCR 反应的基本原理， 掌握 PCR 的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、实验原理PCR 用于扩增位于两端已知序列之间的DNA 区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA 合成。基本原理及过程如下：PCR 循环过程中有三种不同的事件发生：1模板变性；2引物退火； 3热稳定DNA 聚合酶进行DNA 合成。1 变性：加热使模板DNA在高温下 94-95变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2 退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA ，即退火阶段。3 延伸：体系反应温度升至中温72，耐热 DNA聚合酶以单链DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸dNTP ，按 5 到 3 方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。上述 3 步为一个循环，即高温变性、低温退火 、中温延伸3 个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA 量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过 2530 个循环后 DNA 可扩增 106109倍。典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP 、 MgCl2、两条合成的 DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 11 页电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA ，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法别离DNA ，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭EB为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB 发射的荧光强度大10 倍以上，且荧光强度与DNA 的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng 以上的 DNA 。三、实验材料及相关试剂基因组 DNA ，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1模板 DNA 的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA 。2PCR 操作(在冰上操作 )： 1PCR 反应混合液的配制：反应体系25 L, 在无菌的0.2 mL 离心管中按以下操作程序加样：反应物加样顺序体积 / L 终浓度ddH2O 1 n10 x Buffer 2 n1 x 25 mmol/L MgCl23 n1.5 mmol/L 10 mmol/L dNTP 4 n200 mol/L 10 M 上游引物5 1n0.4 mol/L 10 M 下游引物6 1n0.4 mol/L DNA Taq聚合酶7 n1 U 2将反应混合液混匀, 然后每个 PCR 管中分装24 L 反应混合液，再加1 L 模板DNA ，最后加1 滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。3将 PCR 管放到 PCR 热循环仪中，按以下程序开始循环：94 4 min (预变性 ) 94 30 sec, 60 30 sec, 72 2 min 72 7 min 35 个循环4注意事项由于 PCR 灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA 的污染。a. 所有与 PCR 有关的试剂，只作PCR 实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR 管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c. 每加一种反应物，应换新的枪头。3PCR 产物的检测：琼脂糖浓度1.2% ；EB 浓度 5 l / 100 ml TBE 1制胶以150 mL 为例a. 称取 1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的 TBE 缓冲液，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖约50 ，倒入其中，直至厚度为46 mm 如有气泡要把气泡赶出，在室温下冷却凝固( 约 30 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 11 页45 min)；d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 2点样a. 将 2.0 l 溴酚蓝加入到PCR 产物中，然后稍微离心；b. 每孔点样10.0 l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。3电泳打开电源开关，调节电压至35 V/cm ( 约 100 V) ，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1 小时后即可观察。4染色将电泳好的凝胶放入含EB 的水溶液中 , 染色 15-20 分钟。5观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带， 根据条带粗细， 可粗略估计该样品DNA 的浓度。 如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA 条带的相对位置初步估计样品的分子量。6注意事项a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。b. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的时机。c. 倒胶注意厚度4-6 mm ，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱 10 多分钟，以加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB ，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题 ：1 PCR 反应液中主要成分是哪些？在PCR 反应过程中各起什么作用？2 为什么在 PCR 反应过程中，使用三个不同的温度变化？3 用 PCR 扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验三 植物总 RNA 的提取一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取RNA 的方法二、实验原理RNA 是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA ，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA 的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸别离，失活RNA 酶，所以 RNA 从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA ，还有 DNA 、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA 。三、仪器、药品与试剂配方(一) 仪器1 低温离心机2 分光光度计精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 11 页3 琼脂糖胶电泳系统， 用前先用 1% Na OH 溶液浸泡过夜 ,之后再用 DEPC 水浸泡冲洗。4 高压灭菌锅5 研钵、剪刀、一次性手套等(二) 药品1. 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠 (NaAc) 5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸 (EDTA) 10. 琼脂糖11. 异丙醇(三) 试剂配方1 0.1% DEPC 水0.1 ml DEPC 加入 100 ml 三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2. 2 mol/L NaAc 、0.5 mol/L EDTA 、4 mol/L 异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用 DEPC 水配制。3. 5MOPS 电泳缓冲液 (pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L 四、实验步骤（一）总 RNA 的提取方案一1. 实验前 10 天左右播种水稻种子，在3-4 叶期，剪取1.2 g 幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL 离心管。加入4 mol/L 异硫氰酸胍4 mL 苯酚3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿0.6 mL 混匀，冰浴放置30 min。2. 4， 8000 r/min ，离心 13 min。3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。4. 加入 2 倍体积无水乙醇，-70， 0.5 h。5. 4， 8000 r/min ，离心 13 min。6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl ，使其溶解。7. 移入 1.5 mL 离心管中，冰浴2 h。8. 4， 13000 r/min ，离心 15 min。9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC 水，再加入400 uL 氯仿，混匀。10. 4， 13000 r/min ，离心 6 min。11. 取上清 ,并加入 1/10 体积 3 mol/L NaAc ，2 倍体积无水乙醇，-20放置 30 min。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 11 页12. 4， 13000 r/min ，离心 20 min。13. 将沉淀 RNA 用 70%乙醇洗涤2 次。14. 将沉淀 RNA 室温下稍干燥。15. 加 30 uL DEPC 水溶解， -70保存。（二）总 RNA 的提取方案二利用 TRIzol 提取液抽提RNA ，具体步骤如下：1. 取幼叶约250 mg 在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml 离心管；2. 加入 1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；3. 室温放置5 min 后，加入0.5 ml 的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；4. 在 8条件下， 12000 rpm 离心 15 min；5. 溶液分为两层，下层为酚氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5 ml 异丙醇在1530条件下，沉淀10 min；6. 然后在 , 28条件下， 12000 rpm 离心 10 min，RNA 沉淀管壁和底部；7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗 2 次；8. 风干后，加入25 l DEPC 处理过的水溶解RNA ，储藏于 -80冰箱备用。三甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA 1 配制 1.2%变性琼脂糖凝胶(40 mL) 称取 0.48 g, 加入 DEPC 水 25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶解，稍冷却加入甲醛3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h. 2. RNA 电泳检测样品制备RNA 2 l甲醛2.5 l甲酰胺7.5 l10MOPS 2 lRNA Loading Buffer 2 l灭菌的 DEPC 水4 l混合液轻轻混匀并离心，放于65下温育5 min 后，置于冰上。3. 电泳检测将 1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1MOPS 电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。 将 RNA 样品加到凝胶点样孔中，在 5 V/cm 条件下电泳30 min， 然后在 EB 中染色 15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA 的质量。五、注意事项1在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2RNA 酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA 酶外，外界环境中均存在 RNA 酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。思考题：1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么? 焦碳酸二乙酯(DEPC), 吗啉代丙烷磺酸(MOPS), 异硫氰酸胍 , 醋酸钠 (NaAc), 氯仿 , 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 11 页苯酚 , 甲醛 , 乙醇 , 乙二胺四乙酸(EDTA), 异丙醇动植物组织 mRNA 提取实验方法一、材料水稻叶片或小鼠肝组织。二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶180 2 小时装蒸馏水，然后加入0.01%的 DEPC体积 /体积 ，处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC 处理水配制75%乙醇， 用高温灭菌器皿配制，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3 、 1层 析 柱 加 样 缓 冲 液 ； 20mmol/L Tris Cl(pH7.6) ， 0.5mol/L NaCl ， 1mmol/L EDTA(pH8.0) ，0.1% SDS。4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris Cl (pH7.6) ， 1mmol/L EDTA (pH8.0) ，0.05% SDS。四、操作步骤一动植物总RNA 提取 -Trizol 法Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用 Trizol 法提取的总RNA 绝无蛋白和DNA 污染。RNA 可直接用于Northern 斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+ 别离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N 中磨成粉末后， 再以 50-100mg 组织加入1ml Trizol 液研磨， 注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的 10%。2、研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒。3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol 液加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10 分钟， 12000g 离心 10 分钟。4、弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下 7500g 离心 5 分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度。然后将RNA 溶于水中，必要时可55-60水溶10 分钟。 RNA 可进行mRNA 别离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA 沉淀在 70%乙醇中可在4保存一周， -20保存一年。二 mRNA 提取oligo(dT) 纤维素。2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3、用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH 值小于 8.0。4、将一中提取的RNA 液于 65温育 5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x 柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA 溶液进入柱床后，加入1 倍柱床体积的1x 层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260 ，当洗出液中OD 为 0 时，加入2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 11 页6、测定 OD260，合并含有RNA 的洗脱组分。7、加入 1/10 体积的 3M NaAc(pH5.2) ， 2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀，-2030 分钟。8、4下 12000g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀， 4下 12000g离心 5 分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10 分钟，或真空干燥10 分钟。10、 用少量水溶解RNA 液， 即可用于 cDNA 合成 或保存在70%乙醇中并贮存于-70 。注意 1、mRNA 在 70%乙醇中 -70可保存一年以上。2、oligo(dT) 纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入 0.02%叠氮钠 NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。RNA 提取流程RNA total RNA 和信使 RNA(mRNA)的抽提RNA 的提取RNA 和无 RNA 酶的环境原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA, 信使 RNA(mRNA), 核糖体 RNA (rRNA), 转运 RNA(tRNA).而真核生物则能产生四种, 还有一种为真核生物所持有的小 RNA.mRNA 是由基因转录而来的 , 它运送编码蛋白所需的信息. 由于 mRNA 代表了基因表达的水平 , 因此 mRNA 的别离 , 定量和检测极为重要 . 应用 RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中. 由于当前没有一种方法能够直接扩增 RNA, 因此,RNA的别离通常是决定实验结果质量的第一步, 也是关键的一步 . 提取 RNA 过程中防止 RNA 酶的污染所采取的步骤RNA 别离的实用方法既有简单直接的方法( 如别离 rRNA和 tRNA),也有困难和涉及复杂步骤的方法 (如别离 mRNA). 在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA 分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量, 或用于 RNA 的生化研究 , 处理 RNA 样品时必需仔细小心 , 其程度取决于样品的用途和来源. 由于 RNA 酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要 . 对于制备 mRNA 来说这些预防措施尤其重要 . 方案: 工作区域应与进行普通微生物实验的区域别离好, 特别是那些用于细菌接种 , 培养基和试剂配制的区域 , 那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA 的制备和操作 . 通常认为这些区域富含RNA 酶. 如有可能 , 使用标有 无 RNA 酶 的商品试管 , 吸头, 溶液和水 . 通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA 酶, 3) 双蒸水 (ddH2O)和溶液应该用 RNA酶的抑制剂 DEPC( 焦碳酸二乙酯 )进行处理 :每 100mL溶液或水中加入 0.1mL DEPC原液, 放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时 . 然后将溶液高压灭菌15min 使 DEPC 失活. 4) 用分子级的试剂和 DEPC 处理过的水配制的溶液通常没有RNA 酶. 5) 别离 RNA 以前, 将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤 4h以灭活核酶 .精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 11 页如有可能 , 将其他设备也灭菌处理 . 从组织中提取 RNA则要注意 : 动物器官的解剖器械存放组织块的玻璃器皿冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有 RNA 酶, 故在所有步骤中均应戴手套并经常更换. 一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA 酶. 细菌比哺乳动物细胞中有更多的 RNA酶. 因此从这些细胞中制备RNA 应采取更严格的预防措施. 别离后的 RNA 通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA(18s 和 28s) 条带模糊可能说明由RNA 酶引起的 RNA 的降解 . 一步法别离 RNA 应用从组织或细胞中别离细胞的总RNA 从液体样品中别离RNA TRI REAGENT (Tripure) 是一种用于 RNA 别离的商品溶液 . 该法源于 chomc- zynski 的 RNA 别离一步法 . 它更便于使用并且结果更加可靠. 对于来源有限的样品, 我们推荐使用这种试剂 . 这种试剂能从同一样品中同时别离RNA, DNA, 蛋白质. 方案 . 用 l mL Tripure/50-100mg (组织) 匀浆组织样品 . 对于细胞 , 每 10cm2面积( 贴壁的单层细胞 ) 或每 106 个细胞 (细胞沉淀 )使用 1mL.将样品转至 1.5mLEP管中.(- 70 可保存 1 月) 室温下放置样品 5min. 每 1mL Tripure中加入 0.2mL 氯仿并摇动 15s, 置于室温下215min. 4 下 12000g离心 15min. 将水相 ( 上部)转至一个新 EP管. 每 1mL Tripure加入 0.5mL异丙醇沉淀 RNA. 将样品置于室温下 510min. 4 ,12000g 离心 10min. 凝胶样沉淀物为 RNA. 吸出上清并用 1mL 75% 乙醇在涡旋振荡器上洗涤RNA 沉淀一次 , 4 , 7500g 离心 5min. 晾干 RNA沉淀. 然后用无 RNA酶的水 , 甲酰胺或 0.5X 的 SDS溶液溶解沉淀 . RNA 的检测 : 将样品稀释液于三处波长处读取OD值. 记录 OD值, 通过计算确定 RNA 浓度或纯度 . 公式如下对于 ssDNA:ssDNA=33(OD260一 OD310) 稀释倍数对于 dsDNA:dsDNA=50 (OD260 OD 310) 稀释倍数对于 ssRNA:ssRNA=40(OD260一 OD310) 稀释倍数以上浓度单位为 ug/mL. 注意事项1)OD310值是背景 , 假设盐浓度较高 ,OD310值也高 . 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 11 页2)OD260/OD280 对 DNA 而言其值大约为 1.8, 高于 1.8 有 RNA 污染. 低于 1.8 则有蛋白质污染 . 3)OD260/OD280. 对 RNA 而言其值大约为 2.0. 小结所有可能与 RNA接触的器材均得用 DEPC 处理. 操作过程中应带口罩 , 手套. DEPC 有致癌之可能 , 尽量防止接触皮肤提取的 RNA 应尽早逆转录成 cDNA. 逆转录聚合酶链式反应(RTPCR) RT PCR 间接用来扩增从RNA 分子今得到的一段特异序列.RNA首先被逆转录为cDNA.用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以cDNA为摸板的 PCR产物成为一个标准的PCR反应. 得到阳性产物说明存在着特异的RNA 序列. 对于个成功的 PCR 反应来说 , 寡聚核苷酸引物是最重要的组分. 引物的长度范围通常在 18 至 25 个核苷酸之间 . 用常规条件扩增的PCR 产物的长度范围为100一 1000bp.为了扩增从 mRNA 逆转录得到的 cDNA, 引物中应含有一段目的基因的内含子区 , 以便从带有基因组DNA 的 PCR 产物中区分出 cDNA的 PCR 产物. 许多电脑程序 , 诸如 Primer Primer5.0, 使得最适引物的选择十分便利. 评判标准包括 GC含量, 解链温度 , 引物引物二聚体和特异性. 应用1. 利用有限的总 RNA量测定一段持异的RNA 信息; 2. 进行 PCR克隆. 逆转录1) 用分光光度计测定A260以确定 RNA浓度. 2)RT反应混合物包括以下组分(20ul): 0.5 至 l ug RNA . 1.25mmol/L dNTPs(dATP,dTTP, dCTP, dGTP). 1.6 ug 的随机六聚物 (pdN 6). 2uL 10 xRT buffer 200 u 逆转录酶加 DEPC 处理过的双蒸水至总体积为20ul, 于 37反应 lh. 然后于 94 度加热 5min 以终止反应 . PCR 扩增将以下组分混合(50ul)以进行 PCR 扩增 : a.从上面反应中逆转录得到的10ul cDNA. b.1U 的 Taq 聚合酶 . c. 引物 (0.2umol/L). d.5ul 10PCR 缓冲液 (o.5mmol/L MgCl2, 50mmol/L KCl, 10mmol/L TrisHCl,0.001% 明胶 ) e.加双蒸水使总体积为50ul. f. 编程 ,开始 PCR 一步法 RT PCR 优点 :一步法 RT-PCR 排除了在将cDNA 转至 PCR 反应混合体系过程中可能出现的污染和吸量的变化 .防止了在逆转录反应结束阶段的变性过程中可能发生的cDNA 蒸发 . 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 11 页缺点 :对于新手来说 ,一次不成功须从第一步重新开始. 方案0.1-1ug 总 RNA 200 一 500 umol/L 的 dNTP(每种 ) 2 umol/L 随机六聚物pd(N) 200 U AMV 逆转录酶1 Taq 聚合酶缓冲液1 mmo1/L DTT 1.5U Taq 聚台酶0.5umol/L 的引物 (每种 ) 终体积为50ul. 小结 : 半定量时必需设计内参照. 内参的长度与目的片段相差100bp 以上 ,否则电泳时不能很好分开内参的退火温度应与目的片段相当,最好控制在1-2 左右 ,且退火温度不要太高. 有时内参与目的基因引物之间可以形成二聚体,导致条带暗 ,可以分开PCR, 然后加在一起电泳. 进行基因克隆时应在引物上加酶切位点,尽量选用常用酶,如 BamH I,EcoR I, Hind III 等便于连接到表达载体上. 产量低时可通过增加模版量,增加循环数量来解决. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 11 页
