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医用分子遗传学真核生物复制医用分子遗传学真核生物复制（一）（一） 原核生物原核生物DNADNA链的延伸链的延伸延伸延伸反应反应：在在RNARNA引物的引物的OHOH端由端由DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII，按碱基互补按碱基互补规则延伸。规则延伸。前导链的延长前导链的延长： 3 355方向这条链做模板链的方向这条链做模板链的新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成（5 5 3 3）。 型：细菌 滚环式滚环式 X174 D型型 线粒体线粒体DNAA protein: Phage 编码编码滚环可形成多联体滚环可形成多联体裸露闭环双链状裸露闭环双链状 D型复制型复制 H链：富含链：富含G L链：富含链：富含CDNA聚合酶聚合酶 对于对于线性线性DNA复制例如复制例如 噬菌体等比较简噬菌体等比较简单，复制到单，复制到分子末端终止。分子末端终止。 对于对于环状环状的大肠杆菌的大肠杆菌DNA复制和真核生复制和真核生物的物的DNA复制就比较复杂。复制就比较复杂。 复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代代DNA缠绕在一起，需要分开。缠绕在一起，需要分开。 大肠杆菌：大肠杆菌： 有复制起始点，也有复制终止点。有复制起始点，也有复制终止点。 细菌复制终止区含有多个约细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子的终止子(terminator)位点，位点，E. coli 有有7个终止子位点。个终止子位点。 Tus: Terminus utilization substance 线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短，需要在的水解而可能出现缩短，需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。）的催化下，进行延长反应。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒端粒DNA： 端粒和端粒酶发现大事记端粒和端粒酶发现大事记 19391939年，年，Barbara McClintockBarbara McClintock发现玉米细胞的染色体断裂发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合末端容易融合19721972年，年，James WatsonJames Watson提出染色体复制的末端隐缩问题提出染色体复制的末端隐缩问题19781978年，报道年，报道四膜虫四膜虫的端粒序列的端粒序列19821982年，端粒的发现导致人工染色体的发明年，端粒的发现导致人工染色体的发明19841984年，报道年，报道酵母酵母的端粒序列的端粒序列19851985年，报道年，报道四膜虫四膜虫的端粒酶活性的端粒酶活性19891989年，报道年，报道四膜虫四膜虫端粒酶的端粒酶的RNARNA亚基亚基19941994年，报道年，报道酵母酵母端粒酶的端粒酶的RNARNA亚基亚基19951995年，报道年，报道酵母酵母端粒酶活性端粒酶活性19961996年，纯化了年，纯化了四膜虫四膜虫端粒酶的催化亚基端粒酶的催化亚基, ,遗传筛选到遗传筛选到酵母酵母端粒酶的催化亚基端粒酶的催化亚基19971997年，证明了年，证明了四膜虫四膜虫和和酵母酵母端粒酶的催化亚基端粒酶的催化亚基端粒酶(telomerase) 依赖RNA的DNA聚合酶,其实质是一种逆转录酶。 能识别特定的端粒重复序列,以自身RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC- 3)为模板,合成新的端粒重复序列,使端粒延长，保持染色体的完整 不需要DNA 模板 已知的恶性肿瘤特异性最强的标志，永生细胞 生殖细胞，造血干细胞，ips等非肿瘤细胞 端粒的缩短与衰老端粒酶以自身的RNA为模板，在3端合成DNA序列:RNA引物引物端粒酶的爬行模型端粒酶的爬行模型母链藉非标准碱基配对回折母链藉非标准碱基配对回折DNA聚合酶聚合酶端粒合成完成端粒合成完成进一步加工进一步加工 上上世纪之初发现肿瘤世纪之初发现肿瘤RNARNA病毒病毒。 6464年，年，TeminTemin报道了抑制报道了抑制DNADNA合成的放线菌素合成的放线菌素D D能抑制鸡肉瘤能抑制鸡肉瘤RNARNA病毒的繁殖病毒的繁殖。 据此提出鸡肉瘤据此提出鸡肉瘤RNARNA病毒的繁殖须经过形成病毒的繁殖须经过形成DNADNA的阶段。的阶段。v7 70 0年年Temin Temin 和和Baltimore Baltimore 两个实验室同时两个实验室同时从从( (鸡鸡) )劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒中病毒中发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存在着一种以在着一种以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA的酶，称为的酶，称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶。聚合酶。 遗传信息从遗传信息从RNARNA流向流向DNADNA，即以即以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA称为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称称逆转录酶逆转录酶。 由逆转录病毒基因组中由逆转录病毒基因组中polpol基因编码。是一种基因编码。是一种多功能酶多功能酶。 有以有以RNARNA为模板和以为模板和以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA的的DNADNA聚聚合酶活性合酶活性。 需要需要RNARNA或或DNADNA做引物；做引物； 有有核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性（在逆转录酶的的活性（在逆转录酶的C C端），端），能从能从3 355和从和从5 533水解水解RNARNA，使使RNARNA与与DNADNA的的杂交体分离。杂交体分离。1 1 用于合成用于合成cDNA. cDNA. 建立建立cDNAcDNA文库文库( (cDNA cDNA Library)Library)，获得基因或探针。获得基因或探针。2 2 与与PCRPCR连用连用 RT-PCRRT-PCR互补互补DNA（complementary DNA, cDNA） DNADNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNADNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。 无论原核还是真核细胞中无论原核还是真核细胞中DNADNA复制都只发生在细胞复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNADNA必须也必须也只能只能复制一次复制一次。1、起始体起始体 （ orisomeorisome，起始复合物，蛋白质，起始复合物，蛋白质- -ori Cori C复合物）的装配复合物）的装配 参与形成参与形成orisomeorisome的组分：的组分：Dna A, Hu, IHF，Fis，Dpi， Ici A， Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A相互作用相互作用 ：Fis, IHF 调节调节 DnaA-ATP与与oriC oriC 的结合，的结合，HUHU调节调节DnaA, IHF DnaA, IHF 结合到结合到oriC, oriC, 并增强并增强DnaADnaA解链能力。解链能力。2 2、防止复制再次起始、防止复制再次起始(1) Dna A(1) Dna A活性的抑制活性的抑制 Dna A-ADP Dna A-ATPDna A-ADP Dna A-ATP无活性无活性 RIDA RIDA 有活性有活性 RIDA：regulatory inactivation of DnaA ori C(2) 降低游离形式的降低游离形式的Dna A水平水平Dna A结合位点结合位点 dat A区区在复制后极短时间内降低在复制后极短时间内降低 Dna A 水平水平可以结合可以结合300分子的分子的Dna A(3)(3)隔离隔离 ori Cori C ori CGATCCTAG甲基化甲基化未甲基化未甲基化摸板链摸板链新合成链新合成链Seq A 特异识别特异识别,并结合于半甲基化并结合于半甲基化ori C 的的GATC序列序列,使使ori C被隔离被隔离,防止复制再次发生防止复制再次发生1 1、DNADNA复制起始的调控复制起始的调控2 2、细胞周期监控点机制、细胞周期监控点机制主要调控复制的起始1 1、复制起始点的选择复制起始点的选择 复制起始点数量的调控复制起始点数量的调控 真核细胞有多个复制起始点，起用多少起真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于始点决定于S S期的长短。期的长短。 S S期短，起始点多。期短，起始点多。S S期长，起始点少。期长，起始点少。 遗传性起始点：遗传性起始点： DNADNA上的起始元件上的起始元件 功能性起始点：功能性起始点： 实际起始点实际起始点 遗传性起始点多于功能性起始点遗传性起始点多于功能性起始点 酵 母 ： 自 主 复 制 序 列 （酵 母 ： 自 主 复 制 序 列 （ a u t o n o m o u s l y a u t o n o m o u s l y replicating sequeences, ARS)replicating sequeences, ARS) 酵母细胞酵母细胞3 3号染色体上有号染色体上有1414个遗传性复制起始个遗传性复制起始点，只有点，只有6 6个功能性复制起始点。个功能性复制起始点。 将将Ura4Ura4基因处的强复制起始点突变后，在其附基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱复制起始点就成为强复制起始点。近的弱复制起始点就成为强复制起始点。 Ura4Ura4：乳清苷酸脱羧酶乳清苷酸脱羧酶 CHOCHO细胞核细胞核 蟾蜍卵细胞抽提物蟾蜍卵细胞抽提物 损坏损坏CHOCHO细胞核或细胞核或 裸露裸露DNADNA 非随机起始，同正常非随机起始，同正常 随机起始随机起始CHOCHO细胞细胞 复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关（1 1）复制的允许机制（）复制的允许机制（Licensing modelLicensing model） （2）蛋白激酶的调控）蛋白激酶的调控 蟾蜍卵细胞蟾蜍卵细胞 Licensing controlLicensing control 复制复制外源细胞核外源细胞核复制后，复制后，Licensing Factor失活，失活的失活，失活的Licensing Factor不能再次启动复制。核不能再次启动复制。核膜破裂后（细胞分裂后），新的膜破裂后（细胞分裂后），新的Licensing Factor进入核，启动下一周期进入核，启动下一周期的的DNA复制。复制。真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶： CDK 和和 Cdc7-Dbf4激酶激酶(1)、前复制起始复合物前复制起始复合物的形成的形成 组成成分：组成成分：ORC(Origin Recognition Complex) 含含6种种蛋白质，蛋白质，Cdc6，RLF （Replication Licensing Factor, 复制允许因子）。复制允许因子）。(2)、CDK激活激活前前复制起始复合物复制起始复合物 复制前复合物复制前复合物受蛋白激酶的调控，或变成受蛋白激酶的调控，或变成起始复合物起始复合物，起始复制，或在复制过程中转变成起始复制，或在复制过程中转变成复制后复合物复制后复合物，就，就再也不能启动复制。再也不能启动复制。 CDK（CyclinDependent), Cdc7-Dbf4激酶，激酶， 蛋白激酶蛋白激酶A，蛋白磷酸蛋白磷酸酶酶2A，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。都参与复制的起始，在不同阶段起作用。前复制起始复合物前复制起始复合物（pre-replicative complexpre-replicative complex，pre-RC) pre-RC) （在遗传性复制起始点装配）（在遗传性复制起始点装配） CDKCDK起始复合物（起始复合物（Replicative Complex,RC) Replicative Complex,RC) （在功能性复制起始点形成）（在功能性复制起始点形成）在在G1G1期向期向S S期过渡期间，期过渡期间，CDKCDK活性很高。活性很高。 CDKCDK同时又是防止在同一细胞周期中同时又是防止在同一细胞周期中DNADNA复制再复制再次发生的因素次发生的因素, ,阻止复制起始复合物的组装。阻止复制起始复合物的组装。 CDKCDK对某些起始因子磷酸化对某些起始因子磷酸化, ,调控其在细胞内水调控其在细胞内水平。平。 识别识别DNADNA损伤或损伤或DNADNA复制阻断，通过复杂复制阻断，通过复杂的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞周期。周期。在长期进化过程在长期进化过程中，细胞形成一中，细胞形成一套保证细胞周期套保证细胞周期中中DNA复制和染复制和染色体分配质量的色体分配质量的检查机制，即细检查机制，即细胞周期检查点胞周期检查点(1) G1 S S期检查点期检查点查看查看DNADNA有无损伤有无损伤 DNA damage checkpointDNA damage checkpoint 细胞周期暂时减慢或停止。细胞周期暂时减慢或停止。查看查看DNADNA复制的进度复制的进度 DNA replication DNA replication checkpointcheckpoint 限制限制DNADNA复制速度复制速度(2) G2 M 管理染色体的正确分配管理染色体的正确分配 Spindle Spindle assembly checkpointassembly checkpointDNA 损伤类型和产生原因点突变 DNA聚合酶复制错误产生碱基自发的突变：碱基自发的突变：甲基化分析甲基化分析缺失或插入 核苷酸的缺失或插入 碱基的缺失化学修饰 氧化，甲基化，烷化DNA分子交联 顺铂，顺铂，丝裂酶素丝裂酶素DNA分子断裂DNA单链断裂DNA双链断裂：射线，重金属， 病毒整合，DNA重排核苷酸修复 dGTP氧化产生8氧代dGTP 8oxodG 8氧代dGTP三磷酸脂酶 水解 该酶突变：A：TC：G突变高10010000倍dGTP直接修复O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT） 光修复光修复3. 碱基切除修复DNA转葡糖基酶转葡糖基酶 4. 核苷酸切除修复5. 错配修复DNA链断裂的修复非同源末端连接 non-homologous end-joining同源重组修复同源重组修复 homologous recombination7. 大肠杆菌SOS修复Lex A， Rec A修复完成后，修复完成后，DinI蛋白抑制蛋白抑制RecA作用作用 Yeast two hybrid （1）G1期期checkpoint，确保，确保DNA损伤不被复制。这一阶段损伤不被复制。这一阶段，DNA损伤激活蛋白激酶损伤激活蛋白激酶ATM，ATR和和cABL，导致，导致P53的磷酸化，并进一步上调的磷酸化，并进一步上调P21 WAF1表达水平。表达水平。P21可以结合可以结合cyclin-CDK从而调节细胞周期。同时从而调节细胞周期。同时DNA损伤诱导损伤诱导Cdc25A的泛素化和降解，从而阻止细胞周期进行；的泛素化和降解，从而阻止细胞周期进行； （2）S期期checkpoint，主要是当，主要是当DNA损伤在损伤在G1期没有能够进期没有能够进行修复时防止行修复时防止DNA复制；复制； （3）G2期期checkpoint，主要功能是当细胞在，主要功能是当细胞在S期晚期或者期晚期或者G2期期DNA受到损伤时，阻止细胞分离，从而防止受到损伤时，阻止细胞分离，从而防止DNA损伤传递损伤传递到子代细胞中；到子代细胞中； （4）M期期checkpoint，细胞在，细胞在M期染色质将发生固缩形成纺期染色质将发生固缩形成纺锤体结构，在后期姐妹染色体发生分离。当染色体受到损伤锤体结构，在后期姐妹染色体发生分离。当染色体受到损伤时，细胞停滞在时，细胞停滞在M期，染色体重新恢复到染色质，从而使细期，染色体重新恢复到染色质，从而使细胞有机会对胞有机会对DNA损伤进行修复后再进入损伤进行修复后再进入M期。期。 DNA损伤损伤ATM/ATR丝丝/苏氨酸激酶苏氨酸激酶CHK1，CHK2，P53等等抗凋亡基因抗凋亡基因 凋亡相关基因凋亡相关基因线粒体膜通透性升高，细胞线粒体膜通透性升高，细胞色素色素C释放，激活释放，激活Caspase细胞凋亡细胞凋亡 外源性因素：UV，射线，化学试剂等 内源性因素：线粒体呼吸链产生活性氧 reactive oxygen species（ROS），NO 50000个损伤/天细胞 小分子如谷胱甘肽清除自由基 超氧化物歧化酶（SOD）：清除羟基自由基等 缺失导致肿瘤发生 遗传基因的突变，造成出生缺陷 肿瘤 影响细胞代谢，衰老 DNA损伤修复缺陷：胚胎致死或严重疾病一些免疫抑制剂一些免疫抑制剂如环孢霉素如环孢霉素A（cyclosporin A）、硫唑嘌呤（、硫唑嘌呤（azathioprine）能）能插入到插入到DNA链中链中，使得，使得DNA对对UV的敏感性增强，的敏感性增强，更容易导致更容易导致DNA损伤，同时影响损伤，同时影响DNA损伤的核苷损伤的核苷酸切除修复。酸切除修复。环环孢霉素孢霉素A还能抑制还能抑制细胞凋亡，促进细胞凋亡，促进肿瘤细胞生长，肿瘤细胞生长，更增加了更增加了UV引起引起突变并致癌的风突变并致癌的风险。险。 Fair-skinned people MEF细胞体外培养的转化：DNA氧化损伤 NIH3T3成纤维细胞过表达NADPH 氧化酶增加细胞内过氧化物等产生，将促进细胞转化 过氧化物攻击过氧化物攻击DNADNA， 合成前体合成前体 隐性遗传性疾病 核苷酸切除修复相关基因突变核苷酸切除修复相关基因突变 对于光照极度敏感 患皮肤癌的几率比常人高2000倍 生长缺陷和渐行性的智力迟缓 同源重组修复的缺陷同源重组修复的缺陷 DNA断裂或者交联形成损伤进行修复，其中FANC蛋白的突变将导致贫血 造血功能降低，并伴有身体的畸形 对DNA交联试剂如丝裂霉素C，顺铂敏感 Exposure to environmental tobacco smoke in the workplace resulted in a 63% increase in white blood cell DNA 8oxodG levels.