《基因工程的基本操作程序》ppt.ppt

真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成例如：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、例如：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、植物抗病基因等植物抗病基因等1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生将含有某种生物不同基因的物不同基因的许多许多DNADNA片断片断，导入到，导入到受体菌的受体菌的群体群体中，中，各个受体菌分别含各个受体菌分别含有这种生物的不同有这种生物的不同基因，称为基因文基因，称为基因文库。库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(CDNA文库文库)基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(CDNA文库文库)某生物体内某生物体内全部全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体基因组文库的构建基因组文库的构建限制酶限制酶与运载体连接与运载体连接 导入导入基因组文库基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接与运载体连接 导入导入部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）cDNA文库的构建文库的构建基因组文库和部分基因文库比较基因组文库和部分基因文库比较（3）如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等特性。（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR多聚酶链式反应多聚酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术使其。通过此技术使其数量呈数量呈指数指数方式增加，可获取大量的方式增加，可获取大量的目的基因。目的基因。PCR技术技术 原理：原理： 前提：前提： 原料：原料： 方式方式DNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增， 即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n一段已知目的基因的核苷酸序列（一段已知目的基因的核苷酸序列（DNADNA模板模板）引物；引物；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶） 过程：“变性、退火、延伸” 三步曲变性：加热至加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性变性退火退火延伸延伸逆转录法逆转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA 双链双链DNADNA（目的基因（目的基因) )化学合成法化学合成法蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因人工合成人工合成逆转录酶逆转录酶3 3、人工合成目的基因、人工合成目的基因推测推测推测推测单链单链DNADNADNADNA聚合酶聚合酶1、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因 反转录法反转录法 通过通过DNA合成仪利合成仪利用化学方法人工合成用化学方法人工合成A B C DD3、目的基因主要是指、目的基因主要是指_的结构基因。的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中）从基因文库中获取目的基因，根据基因的获取目的基因，根据基因的_序列，基因在序列，基因在_上的位置，基因的上的位置，基因的_产物产物mRNA，基，基因的因的_产物蛋白质等获取目的基因。（产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在技术扩增目的基因，该技术是一项在_完完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成序列，以便于合成_。（。（3）如果基）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方方法。法。 编码蛋白质编码蛋白质核苷酸核苷酸染色体染色体转录转录表达表达体外体外核苷酸核苷酸引物引物人工合成人工合成基因表达载体的作用：基因表达载体的作用：a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？以完成任务吗？为什么？二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程: :1、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起聚合酶识别和结合的部位，是起始密码子始密码子B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对短片段，对mRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别而有所差别A2、目前转基因工程可以、目前转基因工程可以A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离打破地理隔离但不能突破生殖隔离B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离打破生殖隔离但不能突破地理隔离C. 完全突破地理隔离和生殖隔离完全突破地理隔离和生殖隔离D. 部分突破地理隔离和生殖隔离部分突破地理隔离和生殖隔离 C( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上胞并整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便结构简单、操作方便 B繁殖速度快繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌大肠杆菌 枯草杆菌枯草杆菌 支原体支原体 动植物细胞动植物细胞A B C DBD3、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白将编码毒素蛋白的的DNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A B C DC5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管道法花粉管道法 显微注显微注射法射法 胚胎移植胚胎移植 DNA分子杂交法分子杂交法A BC DC( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。1、用、用-珠蛋白的珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是探针可以检测出的遗传病是 A镰刀状细胞贫血症镰刀状细胞贫血症 B白血病白血病C坏血病坏血病 D苯丙酮尿症苯丙酮尿症 A2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成合成-珠蛋白的珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段B思考与探究：思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导若将一个抗病基因导入小麦中入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA)cDNA)。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入珠蛋白基因已进入其中。其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。复习题复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方）将目的基因导入受体细胞有哪些方法法?(试举例说明试举例说明)2）简述农杆菌转化法）简述农杆菌转化法1、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个片段，导入某个 生物生物 体内，则这个生物就是一个基因文库体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文文库库C6 6）（）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（人类胰岛素，这一过程涉及到（ ）A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的筛选出能产生胰岛素的“工程菌工程菌” 7 7）下列哪项不属于基因工程技术的步骤下列哪项不属于基因工程技术的步骤 （ ） A基因转移基因转移 B基因扩增基因扩增C基因检测基因检测 D基因表达基因表达