DNA的粗提取与鉴定课件.ppt

材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大 鸡是真核生物，真核生物的DNA都在染色体上。 鸟类的血细胞核大，DNA多 不需要破除细胞壁 问题：鸡血细胞液在取材之后，到实验前，是否需要特殊处理吗？ 柠檬酸钠抗凝问题：鸡血细胞虽然没有细胞壁，但是依然有细胞膜，以你所学的知识，有什么比较简便但是可行的方法可以破碎细胞膜？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？对于动物细胞我们可以利用细胞的渗透压来破碎细胞，但是很多情况下，人们不得不面对植物材料，那么我们是不是还可以通过加入一定量的蒸馏水来涨破细胞呢？ 洗涤剂的作用： 洗涤剂也分为亲水基团和亲脂基团，可以与细胞膜中的蛋白质结合，使之溶解，进而瓦解细胞膜。 食盐的作用： 食盐中主要含有NaCl，有利于DNA的溶解。 过滤：用34层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤过蛋白质，收集DNA的粘稠物。 问题：这时的滤液可能含有哪些细胞成分？ 主要有DNA、RNA、核蛋白、多糖核蛋白、多糖等 我们应该如何将DNA单独分离出来？DNA溶解在浓度较高的溶解在浓度较高的NaCl溶液溶液中溶液溶液中在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 0.14 mol/Lmol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度的增加而逐渐溶液浓度的增加而逐渐降低；在降低；在0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶溶液浓度继续增加时，液浓度继续增加时，DNADNA的的溶解度又逐渐增大。溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol2 molL L时，时，DNADNA的溶解度的溶解度最大，浓度为最大，浓度为 0 014 mol14 molL L时，时，DNADNA的溶解度最低。利的溶解度最低。利用这一原理，可以使用这一原理，可以使DNADNA在在盐溶液中溶解或析出盐溶液中溶解或析出 用高浓度的盐溶液溶解用高浓度的盐溶液溶解DNA，能，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使低盐浓度使DNA析出，能除去溶析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质解在低盐溶液中的杂质。 缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.10.2mol/L，直到溶液中丝状物不再增加时为止。 方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10-15min 嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶 蛋白酶能分解杂质蛋白，但对蛋白酶能分解杂质蛋白，但对DNA没有影响，没有影响，从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案三：将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温10-15min。 大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60-80 的高温，而的高温，而DNA在在80 以上才会变性以上才会变性 利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。预冷的酒精，可以促进预冷的酒精，可以促进DNA的凝集的凝集 将DNA粘稠物再溶解，继续用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解。 过滤:用34层纱布进行过滤，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。 纯化：向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积份数为95%乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。 DNA的鉴定的鉴定DNA遇遇二苯胺二苯胺（沸水浴沸水浴）会变会变蓝蓝，因此，二苯胺可，因此，二苯胺可以作为鉴定以作为鉴定DNA的试剂。的试剂。 溶解：在物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，放入丝状物，用玻璃棒搅拌，使之溶解。 显色：加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 问题：如果溶液变蓝是否能说明DNA的存在? 设置对照组 除了可以使用二苯胺法，还有什么方法可以鉴定DNA？ 用甲基绿溶液直接滴在有DNA丝状物的载玻片或玻棒上，呈绿色反应在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 0.14 mol/Lmol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度的增加而逐渐溶液浓度的增加而逐渐降低；在降低；在0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶液浓溶液浓度继续增加时，度继续增加时，DNADNA的溶解度的溶解度又逐渐增大。又逐渐增大。DNA遇遇二苯胺二苯胺（沸水浴沸水浴）会）会变变蓝蓝，因此，因此，二苯胺可以作二苯胺可以作为鉴定为鉴定DNA的的试剂。试剂。实验操作小结：实验操作小结：制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放破碎细胞，释放DNADNA 加蒸馏水，同一方向快速加蒸馏水，同一方向快速 搅拌搅拌过滤，除去细胞膜等。过滤，除去细胞膜等。溶解核内溶解核内DNADNA 加入加入NaClNaCl至至2mol/L2mol/L，同一，同一方向缓慢搅拌方向缓慢搅拌DNADNA析出析出 加蒸馏水至加蒸馏水至0.14mol/L0.14mol/L，过滤，再溶解到过滤，再溶解到2mol/L2mol/L溶液中溶液中除去细胞质中的大部分物质除去细胞质中的大部分物质。DNADNA初步纯化初步纯化 与等体积与等体积9595冷却酒冷却酒精混合，析出白色丝状物精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、除去核蛋白、RNARNA、多糖等。、多糖等。DNADNA鉴定鉴定 二苯胺，沸水浴，呈二苯胺，沸水浴，呈现蓝色现蓝色