DNA的粗提取与鉴定课件解读.ppt

材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大 鸡是真核生物，真核生物的DNA都在染色体上。 鸟类的血细胞核大，DNA多 不需要破除细胞壁 问题：鸡血细胞液在取材之后，到实验前，是否需要特殊处理吗？ 柠檬酸钠抗凝一、实验原理一、实验原理、DNA在不同浓度的在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，溶液中的溶解度不同，在在0.14 mol/L的的NaCl溶液中的溶解度最低。溶液中的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的液中的DNA析出。析出。、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出杂质较少的溶液。利用这一原理，可以进一步提取出杂质较少的DNA。、DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。因此，二苯胺可以作为遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。因此，二苯胺可以作为鉴定鉴定DNA的试剂。的试剂。二、目的要求二、目的要求初步掌握初步掌握DNA粗提取和鉴定方法，观察提取出来的粗提取和鉴定方法，观察提取出来的DNA物质。物质。三、材料：三、材料：鸡血细胞液鸡血细胞液（5-10ml），体积分数为），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为为2mol/l和和0.015mol/l的氯化钠溶液，二苯胺试剂的氯化钠溶液，二苯胺试剂 取质量浓度为取质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100ml，置于，置于烧杯中，将新鲜鸡血烧杯中，将新鲜鸡血180ml注入，同时用玻璃棒搅拌，以免凝血，注入，同时用玻璃棒搅拌，以免凝血，然后倒入离心管中用然后倒入离心管中用1000r/min的离心机离心的离心机离心2min，此时，此时，血细胞血细胞沉淀于离心管的底部沉淀于离心管的底部，除去上清液，就可以得到鸡血细胞液。，除去上清液，就可以得到鸡血细胞液。问：问：提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液？中的上清液？四、方法步骤：四、方法步骤：1、制备鸡血细胞液、制备鸡血细胞液鸡血细胞液鸡血细胞液答：上清液是血清，不答：上清液是血清，不含有血细胞，而含有血细胞，而DNA存存在于鸡血细胞中，所以在于鸡血细胞中，所以要把上清液除去。要把上清液除去。 沉淀沉淀加入浓度为加入浓度为0.1g/ml的柠的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）：檬酸钠溶液（抗凝剂）：防止鸡血细胞液凝固。防止鸡血细胞液凝固。新鲜鸡血新鲜鸡血2、提取鸡血细胞的细胞核物质、提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液将制备好的鸡血细胞液5-10ml，注入烧杯中，加入蒸馏水，注入烧杯中，加入蒸馏水20ml，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞的细胞膜和核膜加速血细胞的细胞膜和核膜加速破裂破裂，过滤，取其，过滤，取其滤液滤液。过滤过滤鸡血细胞液鸡血细胞液加入蒸馏水加入蒸馏水20ml。目的是：使细胞吸水涨破，目的是：使细胞吸水涨破，释放出细胞中的释放出细胞中的DNA。获得含核物质滤液获得含核物质滤液 将物质的量浓度为将物质的量浓度为2mol/l的氯化钠溶液的氯化钠溶液40ml加入到滤液中，搅加入到滤液中，搅拌使其混合均匀，这时拌使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。在溶液中呈溶解状态。3、溶解细胞核内的、溶解细胞核内的DNA DNA溶解液溶解液取含核物质滤液取含核物质滤液加入浓度为加入浓度为2mol/L的氯化钠溶液的氯化钠溶液40ml 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时轻轻搅拌，这时会有丝状物出沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时轻轻搅拌，这时会有丝状物出现，随着蒸馏水的加入逐渐增多，一直到现，随着蒸馏水的加入逐渐增多，一直到氯化钠浓度约为氯化钠浓度约为0.14mol/l时时，不再继续增加。不再继续增加。过滤过滤5、滤取含、滤取含DNA 的黏稠物的黏稠物4、析出含、析出含DNA的黏稠物的黏稠物加入蒸馏水。加入蒸馏水。目的是：降低目的是：降低NaCI的浓的浓度，析出度，析出DNA。获得获得DNA的的黏稠物黏稠物(白色白色乳状乳状) 在烧杯中注入物质的量浓度为在烧杯中注入物质的量浓度为2mol/l的氯化钠溶液的氯化钠溶液20ml，使黏稠物尽量多溶解于溶液中。使黏稠物尽量多溶解于溶液中。6、将、将DNA的黏稠物再溶解的黏稠物再溶解用纱布过滤，取其滤液，用纱布过滤，取其滤液，DNA溶于滤液中溶于滤液中7、过滤含有、过滤含有DNA的氯化钠的氯化钠加入浓度为加入浓度为2mol/l的氯的氯化钠溶液化钠溶液20ml过滤过滤获得含获得含DNA的滤液的滤液 在溶液中加入在溶液中加入冷却的酒精溶液冷却的酒精溶液50ml，溶液中出现杂质较少，溶液中出现杂质较少的丝状物（它的主要成分就是的丝状物（它的主要成分就是DNA）。）。8、进一步提取含杂质较少的、进一步提取含杂质较少的DNA加入冷却的酒精加入冷却的酒精溶液溶液50ml含含DNA的滤液的滤液析出含析出含DNA杂质较少的杂质较少的丝状物丝状物9、DNA的鉴定的鉴定 取两支取两支20 mL的试管，各加入浓度为的试管，各加入浓度为0.015 molL的氯化钠溶液的氯化钠溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。颜色的变化。 加入加入0.015氯化氯化钠溶液钠溶液5 mL不加入丝状物不加入丝状物加入加入4mL的二的二苯胺试剂苯胺试剂DNA+二苯胺二苯胺蓝色蓝色加入加入0.015氯化氯化钠溶液钠溶液5 mL加入加入丝状物丝状物加入加入4mL的二的二苯胺试剂苯胺试剂例例：下图为：下图为“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”的实验装置，请回答问题。的实验装置，请回答问题。(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血细胞液中血细胞液中 含量较高。含量较高。(2)在图在图A所示的实验步骤中加蒸馏水所示的实验步骤中加蒸馏水20 mL的目的的目的是是 ，通过图，通过图B所示的步骤取所示的步骤取得滤液，再在滤液中加入得滤液，再在滤液中加入2 mol/L的的NaCl溶液的目的溶液的目的是是 ；图；图C所示实验步骤中所示实验步骤中加蒸馏水的目的是加蒸馏水的目的是 。(3)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可按图，可按图D所示所示进行实验，滴加进行实验，滴加 溶液。溶液。(4)a试管为对照组，试管为对照组，b试管为实验组。试管为实验组。a试管现象试管现象 ；b试管现象试管现象 。在沸水中加热的目的是在沸水中加热的目的是 ，同时说明，同时说明DNA对对高温有较强的高温有较强的 。a试管在实验中的作用是试管在实验中的作用是 。b试管中溶液颜色的变化程度主要与试管中溶液颜色的变化程度主要与 有关。有关。加快颜色反应速度加快颜色反应速度DNA使血细胞吸水涨破，放出使血细胞吸水涨破，放出DNA使滤液中的使滤液中的DNA溶于浓盐溶液溶于浓盐溶液使使DNA析出析出二苯胺二苯胺溶液不变蓝溶液不变蓝溶液变蓝溶液变蓝耐受性耐受性对照对照加入丝状物的多少加入丝状物的多少步骤：步骤：提取血细胞核物质提取血细胞核物质(蒸馏水涨破蒸馏水涨破)溶解溶解(2 mol/L的的NaCl)过滤过滤(含核物质滤液含核物质滤液)析出析出(滴蒸馏水，降滴蒸馏水，降NaCl浓浓度至度至0.14 mol/L)过滤（过滤（DNA的黏稠物）的黏稠物）再溶解再溶解(2 mol/L的的NaCl)过滤（含过滤（含DNA的滤液）的滤液）进一步提纯进一步提纯(体积分数为体积分数为95%的冷却酒精的冷却酒精)鉴定鉴定制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液 方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10-15min 嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶 蛋白酶能分解杂质蛋白，但对蛋白酶能分解杂质蛋白，但对DNA没有影响，没有影响，从而使提取的DNA与蛋白质分开 方案三：将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温10-15min。 大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60-80 的高温，而的高温，而DNA在在80 以上才会变性以上才会变性 利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。结束结束