2022年质粒大提程序 .pdf
质粒大提程序1) 200mL 含有 50mg/mL 氨苄或 30mg/mL 卡纳的培养基中振摇过夜（12-14h）2) 50mL 离心管， 4， 4000rpm,10min 收集 2 份细胞3) 每管加 5mLSTE 悬浮细胞后，4， 4000rpm,10min 收集细胞，置-20贮存 10min 4) 室温解冻后，每管加4mL 冰预冷的溶液，重悬细胞5) 室温下每管加8mL 溶液后充分混匀，室温静置5-10min 6) 每管加 6mL 冰预冷的溶液，充分混匀，冰浴静置10min 7) 4， 11000rpm,30min 收集裂解上清液（用纱布过滤）8) 每管加 0.6 倍体积异丙醇，室温静置10min 9) 4， 8000rpm,15min 收集核酸沉淀，每管加5mL70%乙醇清洗10) 4， 8000rpm,5min 收集沉淀，晾10-15min ，直至管壁无液滴11) 每管加 2mLTE 溶解核酸， 4或冰浴静置30min 12) 每管加 2mL7.5mol/L 乙酸铵溶液，冰浴静置10min 13) 4， 10000rpm,10min 收集上清，每管加4mL 异丙醇，混匀14) 4， 10000rpm,10min 收集沉淀， 4-5mL70% 乙醇清洗沉淀15) 4， 10000rpm,5min 收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴16) 每管加 1mLTE 溶解核酸， 4或冰浴静置30min 17) 两份溶液和到一管，加8L10mg/mLRNase A，混匀转入EP 管（每管转入500L） ，37水浴静置30-60min 18) 每管加 250L 酚，250L 仿醇（24:1）抽提， 4，12000rpm,10min ，收集上清水相 （aL）19) 每管加 aL 仿醇（ 24:1）抽提， 4， 12000rpm,10min ，收集上清水相（bL）20) 每管加 2bL-20 乙醇和0.1bL 乙酸钠溶液， -20静置过夜21) 4， 12000rpm,10min 收集沉淀，每管加200L70%乙醇清洗22) 4， 12000rpm,5min 收集沉淀，晾5-10min，直至管壁无液滴23) 每管加 10-15LTE 溶解沉淀，合并到一个EP 管中，保存于-20冰箱中三、质粒的大量制备在丰富培养基中扩增质粒细菌的收获和裂解收获碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来， 一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有 pMBl 或 ColEl 复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每 500ml 培养物 25mg质粒 DNA ，而且重复性也很好。）将 30ml 含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA 600约 0.6) 。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。）将含相应抗生素的500ml 或 Terrific肉汤培养基（预加温至37）施放入25ml对数晚期的培养物，于37剧烈振摇培养25 小时（摇床转速300 转/ 分），所得培养物的OD 600 值约为 0.4 。）可做可不做：加2.5ml 氯霉素溶液（ 34mg/ml 溶于乙醇），使终浓度为170g/ml 。像名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如 pUC质粒） 可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点， 可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。）于 37剧烈振摇（300 转/ 分），继续培养12-16 小时。（二）细菌的收获和裂解收获）用合适转头于4以 4000 转 / 分离心 15 分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。）将细菌沉淀重悬于100ml 用冰预冷的STE中。STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) ）按步骤）所述方法离心，以收集细菌细胞。，碱裂解法）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物 来自收获细菌的步骤3 重悬于 10ml（18ml）溶液中。溶液50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15 分钟，贮存于。）加 1ml(2ml) 新配制的溶菌酶溶液10mg/ml, 溶于 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。当溶液的pH值低于 8.0 时，溶菌酶不能有效工作。）加 20ml(40ml) 新配制的溶液。溶液0.2mol/L NaOH( 临用前用10mol/L 贮存液现用现稀释）1SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10 分钟。）加 15nl(20ml)用冰预冷的溶液。溶液5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液对钾是mol/L ，对乙酸根是5mol/L 。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0放置后所形成的沉淀应包括染体DNA 、高分子量RNA和钾 SDS 蛋白质膜复合物。）用合适转头于4以 4000 转 / 分离心 15 分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000 转/ 分再度离心20 分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液与细菌裂解物混合不充分 步骤） 。）上清过滤至一250ml 离心瓶中， 加 0.6 体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10 分钟。）用合适转头于室温以500 转/ 分离心 15 分钟，回收核酸。如于4离心，盐也会了生沉淀。）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70乙醇洗涤沉积管壁。 倒出乙醇， 用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。）用 3ml TE(pH8.0) 溶解核酸沉淀。10）纯化。四、质粒的纯化聚乙二醇沉淀法质粒氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒）将核酸溶液所得转入 15mlorex 管中，再加 3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于下以10 000 转 / 分离心 10 分钟。 LiCl可沉淀高分子RNA 。）将上清转移到另一30mlCorex 管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用 SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000 转/ 分离心 10 分钏，回收沉淀的核酸。）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70乙醇洗涤沉淀及管壁， 流尽乙醇， 用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。）用 500l 含无 DNA酶的胰 RNA酶(20 g/ml ）的 TE （pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30 分钟。）加 500l 含 13（ w/v) 聚乙二醇（ PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl, 充分混合，用微量离心机于以12000g 离心分钟，以回收质粒。）吸出上清，用400 l TE(pH8.0) 溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽次。）将水相转到另一微量离心管中，加 100 l 10mol/L 乙醇铵， 充分混匀， 加倍体积 （约1ml）乙醇， 于室温放置10 分钟，于 4以 12 000g 离心 5 分钟，以回收沉淀的质粒。）吸去上清，加200 l 处于 4以 12 000g 离心 2 分钟。）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用 500l TE （pH8.0）溶解沉淀1:100 稀释 用 TE（pH8.0) 后测量 OD 260，计算质粒 DNA的浓度（ 1OD260 50g 质粒 DNA/ml），然后将DNA贮于 20。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -
