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基因工程（基因工程（genetic engineering） 20世纪世纪70年代以来，分子生物学、生物化学、免疫学形成了一项年代以来，分子生物学、生物化学、免疫学形成了一项 融科研、生产、开发为一体的新兴科技领域融科研、生产、开发为一体的新兴科技领域-生物技术生物技术 （biotechnology), 基因工程基因工程 四大工程四大工程 细胞工程细胞工程 蛋白质工程蛋白质工程 酶工程酶工程 基因工程技术基因工程技术 两大技术两大技术 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 一、基因工程的定义一、基因工程的定义 基因工程是在分子水平上，用人工方法提取或制备基因工程是在分子水平上，用人工方法提取或制备DNA 通过载体通过载体 在体外切割、拼接和重新组合在体外切割、拼接和重新组合 把重组把重组DNA分子导入分子导入 受体细胞受体细胞 使外源使外源DNA在受体细胞中进行复制、表达在受体细胞中进行复制、表达 生产出人们所需要的产物，或定向创造生物的新性状，并使生产出人们所需要的产物，或定向创造生物的新性状，并使 之稳定传给下一代之稳定传给下一代.二、克隆（二、克隆（clone) 基因工程中基因工程中 最重要的工作是进行分子克隆最重要的工作是进行分子克隆 (molecular cloning) clone:通过通过无性无性繁殖所产生的与繁殖所产生的与亲代完全相同的子代群体亲代完全相同的子代群体 （ A clone is a large population of identicalA clone is a large population of identical molecules, bacteria, or cells that arise molecules, bacteria, or cells that arise from a common ancestor. from a common ancestor.） 来自同一始祖的相同副本或拷贝来自同一始祖的相同副本或拷贝(copy)(copy)的集合的集合. . clone技术有三个层次技术有三个层次 整体水平整体水平：克隆羊多莉的出现：克隆羊多莉的出现 细胞水平细胞水平：制备单克隆抗体时：制备单克隆抗体时 分子水平（即分子克隆）分子水平（即分子克隆）：即制备：即制备 DNA片段，通过载体导入受体细片段，通过载体导入受体细 胞，在受体细胞中复制、扩增，以胞，在受体细胞中复制、扩增，以 获得单一获得单一DNA分子的大量分子的大量copy. 我国，上海，我国，上海，TaoTao（牛），它的乳汁中含有人血清白蛋白，（牛），它的乳汁中含有人血清白蛋白， 实质是乳腺生物发生器，即把人血清白蛋白基因整合到牛受精卵实质是乳腺生物发生器，即把人血清白蛋白基因整合到牛受精卵 染色体与染色体与泌乳泌乳相关基因上。再如：牛肉味的番茄相关基因上。再如：牛肉味的番茄 现在，人们将现在，人们将 DNA重组技术重组技术 同义词无本质区别同义词无本质区别 基因工程技术基因工程技术 分子克隆技术分子克隆技术大西洋鮭魚體內有無額外表現大西洋鮭魚之大西洋鮭魚體內有無額外表現大西洋鮭魚之生長激素生長激素之之比較圖比較圖A組組:無額外表現者無額外表現者; B組組:具有額外表現者具有額外表現者 (圖片源圖片源於自然雜誌西元於自然雜誌西元2000第第406卷卷)ABB. 食用魚類食用魚類Genetic engineering mice基因工程之產物基因工程之產物-置入生長激素置入生長激素C. 醫學用途醫學用途(基礎研究基礎研究) 第一节、工具酶第一节、工具酶 （Tool Enzyme） 基因工程中许多工作都涉及到对基因工程中许多工作都涉及到对DNA进行切割、重进行切割、重 组、修改、合成，这些都是通过酶的作用来完成的。组、修改、合成，这些都是通过酶的作用来完成的。一、限制酶（一、限制酶（restriction enzyme)1、定义：是一类能、定义：是一类能识别识别和和切割双链切割双链DNA分子分子内内特定碱基特定碱基 序列序列的的核酸内切酶核酸内切酶。所谓限制（。所谓限制（ restriction ），就），就 是指切割（是指切割（cleavage) 许多细菌具有免疫的防卫系统，即限制与修饰系统（许多细菌具有免疫的防卫系统，即限制与修饰系统（R-M系系 统），该系统对外来统），该系统对外来非己非己DNA通过限制作用使其降解，对自己通过限制作用使其降解，对自己 DNA则加以修饰而不受限制作用的降解则加以修饰而不受限制作用的降解 限制：由限制酶来实现限制：由限制酶来实现 修饰：由甲基化酶实现修饰：由甲基化酶实现2、多数限制酶是从细菌中发现，分为、多数限制酶是从细菌中发现，分为3类类 、：同时有限制、修饰功能：同时有限制、修饰功能 ：特异性强、无修饰作用，被誉为分子生物学：特异性强、无修饰作用，被誉为分子生物学家家的手术刀的手术刀 3、限制酶的命名、限制酶的命名 第一个字母：该酶的细菌属名第一个字母：该酶的细菌属名 第二、三个字母：该酶的细菌种名，小写第二、三个字母：该酶的细菌种名，小写 第四个字母：该酶的株名第四个字母：该酶的株名4 4、类限制酶的作用特点：类限制酶的作用特点： 1 1）有严格的识别、切割序列，以内切的方式水解双链）有严格的识别、切割序列，以内切的方式水解双链DNADNA中磷中磷 酸二酯键。酸二酯键。 2 2）识别序列通常为）识别序列通常为4-6 bp4-6 bp的回文结构（的回文结构（palindrome),palindrome),即即180180 GGGCCC GGGCCC 旋转对称的结构。旋转对称的结构。 CCCGGGCCCGGG 3）切割后产生三种不同的切口：）切割后产生三种不同的切口： A 平头末端或钝性末端（平头末端或钝性末端（blunt end): 在识别序列的对称轴在识别序列的对称轴 上，对双链上，对双链DNA同时切割。同时切割。 如：如： 5-GGCC-3 Hae 5-GG CC-3 + 3-CCGG-5 3-CC GG-5 B 5端突出的粘性末端（端突出的粘性末端（cohesive end or sticky end) 在识别序列的两个对称点上切开在识别序列的两个对称点上切开DNA链，产生带单链尾巴链，产生带单链尾巴 的粘性末端。的粘性末端。 如：如：5-GAATTC-3 EcoR 5-G + AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5 C. 3端突出的粘性末端：从端突出的粘性末端：从3端切割端切割 如：如：5-CTGCAG-3 Pst 5-CTGCA + G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-55、 同功异源酶：来源不同，但识别和切割位点相同的酶同功异源酶：来源不同，但识别和切割位点相同的酶 如：如：BamHI 和和 Bst（GGATCCGGATCC）6 6、同、同尾尾酶：识别序列不同、但可产生相同的粘性末端酶：识别序列不同、但可产生相同的粘性末端 如：如： BamHI（GGATCC）和）和San3AI(NGATCC)7、不同限制酶作用时所需要的盐浓度不同，应使用相应的缓冲液、不同限制酶作用时所需要的盐浓度不同，应使用相应的缓冲液 二、二、 修饰酶修饰酶（一）（一）DNA 聚合酶聚合酶（DNA polymerase ) 来源于来源于E.coli, Mr 109KD,有三种酶活性（多功能酶）：有三种酶活性（多功能酶）： 1、 5 3聚合酶活性：以聚合酶活性：以DNA为模板，为模板，dNTP为原料，使为原料，使 DNA链从链从5-3 延伸延伸 2、5 3外切酶活性，外切酶活性，5 3 3、3 5外切酶活性：外切酶活性： 5 3 应用：应用： 缺口平移法（缺口平移法（nick translation）标记）标记DNA探针探针 Klenow 片断片断：是是DNA pol的一个大片断，的一个大片断，Mr 76KD，去掉，去掉5 3 外切酶活性，保留外切酶活性，保留5 3聚合酶活性，聚合酶活性， 3 5外切酶活性外切酶活性应用：应用： A、补齐双链、补齐双链DNA的的3 端端 B、通过补齐、通过补齐3-端使端使3 端标记端标记 C、在、在cDNA克隆中，用于克隆中，用于cDNA第二链的合成第二链的合成 D、DNA序列分析序列分析RNase Hklenow 大片段合成第二链AAAAAAAA.AAAAAAAA-3 mRNATTTTTTTT.TTTTTTTT-5Oligo dT 12-18 bp primerReverse TransciptaseMg2+, dNTPAAAAAAAA.AAAAAAAA-3mRNATTTTTTTT.TTTTTTTT-5cDNA （二）逆转录酶（二）逆转录酶（reverse transcriptase) 是依赖于是依赖于RNA的的DNA聚合酶，用于将聚合酶，用于将mRNA反转录成反转录成cDNA 构建构建cDNA文库。常用的逆转录酶有两种：文库。常用的逆转录酶有两种： AMV：来源于禽成骨细胞性白血病病毒：来源于禽成骨细胞性白血病病毒 从病毒颗粒从病毒颗粒 MMLV：来源于小鼠白血病病毒：来源于小鼠白血病病毒 中得到。中得到。（三）（三）T4 DNA ligase 将两段将两段DNA分子拼接起来的酶，叫分子拼接起来的酶，叫DNA连接酶，连接酶， 催化催化5-P和和3-OH 形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。 （四）碱性磷酸酶（四）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase) 作用：能去除作用：能去除DNA或或RNA 5-端的磷酸根端的磷酸根 用途：防止载体自身成环，提高重组效率用途：防止载体自身成环，提高重组效率 （五）末端脱氧核苷酰转移酶（五）末端脱氧核苷酰转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) 作用：催化作用：催化dNTP加到加到DNA的的3-OH 端端 用途：用途：A、3- 端标记，制备探针端标记，制备探针 B、给载体和待克隆的片段接上互补的同聚、给载体和待克隆的片段接上互补的同聚 物尾，造成便于重组的人工粘性末端物尾，造成便于重组的人工粘性末端 第二节第二节 载载 体体 （vector）一、定义：用来携带目的基因片段进入受体细胞的一、定义：用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA 克隆载体：用来克隆和扩增克隆载体：用来克隆和扩增DNA片段的载体片段的载体 按功能分按功能分 表达载体：用来在宿主细胞中表达外源基因的载体表达载体：用来在宿主细胞中表达外源基因的载体 （表达载体比克隆载体复杂，多一些与（表达载体比克隆载体复杂，多一些与表达调控表达调控有关的元件）有关的元件）二、克隆载体应具备的条件：二、克隆载体应具备的条件：（一）能够在受体细胞中复制，并能携带重组（一）能够在受体细胞中复制，并能携带重组DNA片段一同扩增片段一同扩增（二）带有遗传标志，便于筛选，如（二）带有遗传标志，便于筛选，如 Amp r 编码一个酶，可将氨编码一个酶，可将氨 苄青霉素的苄青霉素的-内酰胺环水解，解除其毒性。内酰胺环水解，解除其毒性。Tet r 编码一种膜编码一种膜 结合蛋白，阻止四环素进入细胞结合蛋白，阻止四环素进入细胞（三）带有多克隆位点（三）带有多克隆位点（multiple cloning site, MCS )，即，即限制限制性性 内切酶的识别、切割、位点。内切酶的识别、切割、位点。MCS是外源是外源DNA插入的部位。插入的部位。 （四）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在（四）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在 表达载体表达载体除除了了有克隆载体的特点外，尚有启动子（在插入有克隆载体的特点外，尚有启动子（在插入 DNA片段的上游）、核糖体结合位点、转录起片段的上游）、核糖体结合位点、转录起始始信号和起始信号和起始 密码、插入密码、插入DNA片段的下游有转录终止信号和终止密码。片段的下游有转录终止信号和终止密码。 三、三、 常用的克隆载体：常用的克隆载体：（一）（一） 质粒（质粒（plasmid): plasmid): 是是细菌细菌染色体染色体以以外外的能的能自主复自主复 制制的的环状闭合双链环状闭合双链DNADNA分子分子。 如：如：PBR322PBR322质粒，质粒，PUCPUC系列系列 包装容量（允许插入外源包装容量（允许插入外源DNADNA的长度，的长度，size)size)： 10kb10kb (二）二）噬菌体（噬菌体（bacteriaphages，phages)： 是感染细菌的是感染细菌的病毒病毒 溶源性（溶源性（ lytic) 按其生活周期分为按其生活周期分为 溶菌性溶菌性(lysogenic(lysogenic) ) 噬菌体是噬菌体是48.5kb的双链线形的双链线形DNA分子分子 COS位点：分子两端各有位点：分子两端各有12个碱基的互补单链个碱基的互补单链 是天然的粘性末端，称是天然的粘性末端，称COS位点，可成环状位点，可成环状 包装容量：包装容量：20kb+BamH IEcoR ISal IBamH IEcoR ISal IBamH IEcoR ISal IBamH IEcoR ISal I44 kb44 kbEMBL3EMBL421 kb13 kb10 kb图图8-2 EMBL 3和和 EMBL 4 结构简图结构简图 ( 三）粘性质粒三）粘性质粒( 柯斯质粒、柯斯质粒、cosmid vector ) 质粒质粒DNA：有抗药基因，：有抗药基因，MCS，自我复制，自我复制 组成组成 噬菌体噬菌体 ：COS位点位点 包装容量：包装容量：40Kb+（四）四）M13 噬菌体：噬菌体： 单链单链闭合环状闭合环状DNA分子，感染细菌后可转变为分子，感染细菌后可转变为双链双链的的 复制型复制型DNA（replicational form DNA, RF DNA) 包装容量：包装容量： 1kb( 五）酵母人工染色体载体（五）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector,YAC) 酵母基因：着丝粒、端粒酵母基因：着丝粒、端粒 YAC组成组成 质粒质粒DNA：ori、Ampr 包装容量：包装容量：0.5-2Mb 细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC) 包装容量：包装容量： 0.1- 0.4Mb 哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome, MAC) 目前也在发展中。目前也在发展中。 二二 、表达载体（、表达载体（expressing vector) 用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体 克隆载体所具备的条件克隆载体所具备的条件 具备条件具备条件 转录和翻译所必需的转录和翻译所必需的DNA序列序列（一）大肠杆菌表达载体（一）大肠杆菌表达载体 表达元件：启动子表达元件：启动子RBS克隆位点（外源克隆位点（外源DNA的插入的插入 位点）位点） 转录终止信号转录终止信号 1、 promoter: 常用常用tac、噬菌体、噬菌体 PL、 T 7 噬菌体启动子噬菌体启动子 1） tac启动子：全称启动子：全称 trp-lac启动子，是一个双启动子、杂合启启动子，是一个双启动子、杂合启 动子，组成：动子，组成：trp P + lac O + SD lac阻抑物可抑制其表达阻抑物可抑制其表达 IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）可诱导其表达（异丙基硫代半乳糖苷）可诱导其表达 2） 噬菌体噬菌体P PL L启动子：受控于启动子：受控于温度敏感温度敏感的阻抑制（的阻抑制（cIts857)cIts857) 是一个温度诱导的启动子是一个温度诱导的启动子 37度时，度时，cIts857可以阻抑可以阻抑PL启动子的转录启动子的转录 42度时，失去阻抑作用度时，失去阻抑作用 3）T 7 噬菌体启动子：表达效率高，需特殊的受体菌。噬菌体启动子：表达效率高，需特殊的受体菌。 2、核糖体结合位点（、核糖体结合位点（ribosome-binding site, RBS) RBS是大肠杆菌表达载体中必不可少的元件是大肠杆菌表达载体中必不可少的元件 3、转录终止序列：多数外源基因的表达需要转录终止序列、转录终止序列：多数外源基因的表达需要转录终止序列（二）哺乳动物表达载体（二）哺乳动物表达载体 真核表达载体含有一套真核表达元件：启动子真核表达载体含有一套真核表达元件：启动子/ 增强子增强子克隆克隆 位点位点终止信号和加终止信号和加poly(A)信号信号 1、启动子、启动子/ 增强子必须是真核细胞的，有些来源于病毒的启动子增强子必须是真核细胞的，有些来源于病毒的启动子/ 增强子常用，如：增强子常用，如：SV40病毒，人类巨细胞病毒（病毒，人类巨细胞病毒（CMV） 2、真核载体必须带有、真核载体必须带有poly(A)位点下游序列，以保证位点下游序列，以保证 新转录的新转录的mRNA能够加上能够加上 poly(A)，即，即GU富含区或加尾富含区或加尾 信号信号AAUAAA 第三节第三节 重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程 克隆克隆某个特定基因某个特定基因 重组重组DNA技术的目的技术的目的 表达表达某个特定基因某个特定基因 基本过程包括：基本过程包括： 1 目的基因的获取和载体的选择构建目的基因的获取和载体的选择构建 2 目的基因与载体的拼接目的基因与载体的拼接 3 重组重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 4 DNA重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定 5 DNA重组体扩增、表达及其他研究重组体扩增、表达及其他研究提取生物体全部提取生物体全部DNA,DNA,酶切后与同一酶切后与同一RNase Hklenow 大片段合成第二链AAAAAAAA.AAAAAAAA-3 mRNATTTTTTTT.TTTTTTTT-5Oligo dT 12-18 bp primerReverse TransciptaseMg2+, dNTPAAAAAAAA.AAAAAAAA-3mRNATTTTTTTT.TTTTTTTT-5cDNA 二二 载体的选择和制备载体的选择和制备 噬菌体、粘性质粒：适用于构建基因组文库噬菌体、粘性质粒：适用于构建基因组文库 pUC系列质粒：适用于构建系列质粒：适用于构建cDNA文库，克隆较文库，克隆较小小 的的DNA片段片段 M13噬菌体：适用于噬菌体：适用于DNA测序测序 表达载体：适用于表达某个特定的基因表达载体：适用于表达某个特定的基因 三三 DNADNA分子的体外连接分子的体外连接 重组重组DNADNA分子指目的分子指目的DNADNA与载体与载体DNADNA组成的杂种组成的杂种DNADNA分分 子子, , 又称嵌合又称嵌合DNA (chimera)DNA (chimera) (1) (1)同一限制酶切割位点的连接同一限制酶切割位点的连接: : 同一限制酶切割供体和载体同一限制酶切割供体和载体DNA DNA 产生相同的粘产生相同的粘 性末端性末端 DNADNA连接酶连接成新的连接酶连接成新的DNADNA分子。分子。 优点：简单、高效。克隆繁殖后用同一限制酶消化，可优点：简单、高效。克隆繁殖后用同一限制酶消化，可 回收目的基因回收目的基因 缺点：高背景（载体缺点：高背景（载体DNADNA两端也具有粘性末端，可自身环两端也具有粘性末端，可自身环 化成空白载体）化成空白载体） 防止办法：防止办法：1 1、用高浓度的外源、用高浓度的外源DNADNA（插入片段与载体比（插入片段与载体比 例例 5- 105- 10：1 1） 2 2、用碱性磷酸酶将载体的、用碱性磷酸酶将载体的5-P5-P切去，不能自切去，不能自 身成环。身成环。 ( (二）二） 人工接头连接人工接头连接 人工接头：人工合成含多种常用限制酶识别序列的双链人工接头：人工合成含多种常用限制酶识别序列的双链DNA 短片段（短片段（8-12bp)，此即接头（，此即接头（linker) 作用：平端添加新的酶切位点，产生粘性末端，便于连接。作用：平端添加新的酶切位点，产生粘性末端，便于连接。（三）同聚体尾连接（三）同聚体尾连接 方法：利用末端转移酶（方法：利用末端转移酶（TdT），催化），催化dNTP加到加到DNA3末端末端 构成脱氧核苷酸的同聚体尾构成脱氧核苷酸的同聚体尾 如：载体如：载体DNA-3-OH加加polyG, + 目的基因目的基因3-OH加加polyC DNA连接酶连接酶 重组体重组体 （四）四） 平端连接平端连接 方法：方法： 可在可在DNA连接酶作用下直接连接平端的连接酶作用下直接连接平端的 DNA片段与载体。片段与载体。 缺点：效率低，需更多的缺点：效率低，需更多的 ATP及及DNA连接酶连接酶四四 将外源将外源DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞（一）转化：指将质粒或其他外源（一）转化：指将质粒或其他外源DNADNA导入受体细胞的过导入受体细胞的过 程。转化常用的宿主菌是：大肠杆菌程。转化常用的宿主菌是：大肠杆菌 感受态细胞（感受态细胞（competent cell):competent cell):用理化方法诱导细胞，用理化方法诱导细胞， 使细胞处于最适合摄取和容忍外源使细胞处于最适合摄取和容忍外源DNADNA的生理状态的生理状态 感受态后才有较高的转化效率，这种细胞称为感受态细感受态后才有较高的转化效率，这种细胞称为感受态细 胞胞 制备感受态细胞常用的方法：制备感受态细胞常用的方法： 1、化学法：用冰冷、低渗的氯化钙溶液，细菌处于氯化钙低渗溶、化学法：用冰冷、低渗的氯化钙溶液，细菌处于氯化钙低渗溶 液中液中 细胞膨胀成球形细胞膨胀成球形 通透性增加，通透性增加，DNA黏附于细黏附于细 胞表面胞表面 经经42短暂热休克处理短暂热休克处理 促进细胞吸收促进细胞吸收DNA 高频电流高频电流 2、电穿孔法：外源、电穿孔法：外源DNA和大肠杆菌混合于电穿孔杯和大肠杆菌混合于电穿孔杯 细胞出现许多小孔细胞出现许多小孔 DNA进入细胞进入细胞 （二）感染（二）感染 (infection)：以：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为病毒为 载体的重组载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒分子，在体外包装成具有感染能力的病毒 或噬菌体颗粒，感染宿主细胞的过程。或噬菌体颗粒，感染宿主细胞的过程。 感染效率远远高于转化效率感染效率远远高于转化效率 粘粒也可经转化程序，将粘粒也可经转化程序，将DNA导入宿主细胞，但转化效率非导入宿主细胞，但转化效率非 常低。常低。 （三）（三）转染转染(transfection(transfection) )：是由转化和感染两个词构成：是由转化和感染两个词构成 的新词，指的新词，指真核细胞真核细胞主动摄取或被动导入主动摄取或被动导入DNADNA而获而获 得新的表型的过程。得新的表型的过程。 五五 目的基因的筛选和鉴定目的基因的筛选和鉴定 筛选在不同的水平上进行，以区别筛选在不同的水平上进行，以区别 1 转化子和非转化子：并非每个细胞都能被转化转化子和非转化子：并非每个细胞都能被转化 2 重组子与非重组子：转化的细胞并非都含有目的基重组子与非重组子：转化的细胞并非都含有目的基 因，可能有的是含有自身成环因，可能有的是含有自身成环 的载体的载体 3 鉴定特异性重组子：一个载体可能与两个外源鉴定特异性重组子：一个载体可能与两个外源DNA 连接，或非目的基因插入载体连接，或非目的基因插入载体（一）遗传学方法（一）遗传学方法 1、转化子和非转化子的筛选、转化子和非转化子的筛选抗菌素平板筛选抗菌素平板筛选 质粒、粘粒：有抗药标记，在含质粒、粘粒：有抗药标记，在含Amp或或Tet平板上能生长的平板上能生长的 - 转化子，未被转化的细菌就被杀死转化子，未被转化的细菌就被杀死 2、重组子与非重组子的筛选、重组子与非重组子的筛选插入失活筛选插入失活筛选（1）插入失活（）插入失活（ insertion inactivation): 许多载体带有两个或许多载体带有两个或 两个以上抗药基因，外源两个以上抗药基因，外源DNA插入某一抗药基因内该基因就插入某一抗药基因内该基因就 会失活会失活 如如PBR322质粒含质粒含Ampr,Tetr , Tetr上有一个上有一个BamH 位点，如位点，如 将外源将外源DNA通过通过BamH 位点插入到位点插入到Tet r基因内，基因内， Tet r 基因基因 失活失活 转化细胞只能在转化细胞只能在Amp平板上生长，不能在平板上生长，不能在Tet平板上平板上 生长生长 若在若在Amp和和Tet平板上都能生长，则可能是平板上都能生长，则可能是PBR322自身成环自身成环 后的转化子后的转化子（2） -互补互补（-半乳糖苷半乳糖苷酶酶显色显色反应，兰白斑选择反应，兰白斑选择） 某些载体中插入了编码某些载体中插入了编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N-端端145个氨基酸的核个氨基酸的核 苷酸序列苷酸序列 ， 即即lacZ gene，其中含多克隆酶切位点，其中含多克隆酶切位点无外源无外源DNA插入时插入时 载体表达载体表达-肽肽（在（在IPTG活化下）活化下） 宿主编码宿主编码-肽缺陷的肽缺陷的-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（肽）肽） 互补互补 有活性的有活性的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 X-gal（酶的底物）（酶的底物） 兰色菌斑兰色菌斑有外源有外源DNA插入插入lacZ时时 插入失活插入失活 载体不表达载体不表达-肽肽 无无有有活性的活性的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 白色菌斑白色菌斑（阳性重组子为白色菌斑）（阳性重组子为白色菌斑）（二）免疫学方法：（二）免疫学方法： 当外源基因在宿主细胞实现表达当外源基因在宿主细胞实现表达 外源蛋白外源蛋白 抗该外源蛋白抗体抗该外源蛋白抗体 目的基因编码的蛋白做抗原目的基因编码的蛋白做抗原（三）核酸杂交法：（三）核酸杂交法： 菌落原位杂交菌落原位杂交 分子杂交分子杂交 斑点杂交斑点杂交 Southern blotting 探针：与目的基因互补的探针：与目的基因互补的DNA序列序列（四）（四）PCR技术技术 根据目的基因序列设计引物，具有高度的灵敏度和特异性根据目的基因序列设计引物，具有高度的灵敏度和特异性（五）电泳筛选（五）电泳筛选 从含有质粒的菌落中抽提从含有质粒的菌落中抽提DNA 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 跑的慢的跑的慢的 外源外源DNA插入插入 （一）磷酸钙共沉淀法（一）磷酸钙共沉淀法 （ 外源外源DNA或重组或重组DNA 磷酸钙磷酸钙 微小颗粒微小颗粒 + 宿主细胞宿主细胞 颗粒沉积在细胞表面颗粒沉积在细胞表面 利于宿主细胞摄取利于宿主细胞摄取（二）电穿孔法：同原核细胞（二）电穿孔法：同原核细胞（三）（三）DEAE葡聚糖（葡聚糖（DEAE-Dextran）法）法 DNA 黏附于细胞表面黏附于细胞表面 + 借助细胞内吞促进借助细胞内吞促进 DEAE-Dextran 外源外源DNA进入进入 （四）脂质体（四）脂质体（liposome）介导基因导入）介导基因导入 阳离子脂质体阳离子脂质体 黏附于细胞表面黏附于细胞表面 混合物混合物 DNA被释放到胞浆被释放到胞浆 DNA（五）显微注射法（五）显微注射法 将外源基因通过毛细玻璃管在显微镜下直接注射到细胞核内将外源基因通过毛细玻璃管在显微镜下直接注射到细胞核内 一一 原核与真核基因在结构及表达调控上的差异原核与真核基因在结构及表达调控上的差异（一）真核基因的启动子不能被（一）真核基因的启动子不能被E.coli RNA聚合酶所识别，所以聚合酶所识别，所以 不能有效转录不能有效转录 （二）真核基因内含内含子，而原核细胞缺乏真核细胞的转录后加（二）真核基因内含内含子，而原核细胞缺乏真核细胞的转录后加 工，即转录产物工，即转录产物hnRNA不能加工成不能加工成mRNA，所以要表达的，所以要表达的 真核基因必须是真核基因必须是mRNA的反转录产物的反转录产物-cDNA（不含内含子）（不含内含子） （三）真核基因转录的（三）真核基因转录的mRNA缺乏缺乏S-D序列，所以不能被翻译序列，所以不能被翻译（四）原核细胞内缺乏真核细胞特有的翻译后加工体系，所以原核（四）原核细胞内缺乏真核细胞特有的翻译后加工体系，所以原核 表达体系仅适用于表达那些翻译后修饰对其生物学功能并非表达体系仅适用于表达那些翻译后修饰对其生物学功能并非 必需的真核蛋白必需的真核蛋白 （五）某些真核蛋白具有信号肽序列（五）某些真核蛋白具有信号肽序列（signal sequence） 信号肽信号肽 被真核细胞的被真核细胞的 蛋白前体蛋白前体 信号肽酶识别信号肽酶识别 + 加工成成熟的蛋白加工成成熟的蛋白 原核细胞内表达此蛋白前体后原核细胞内表达此蛋白前体后 信号肽不能被切除信号肽不能被切除 蛋蛋 白前体无活性，所以表达的真核基因需要删除信号肽序列，白前体无活性，所以表达的真核基因需要删除信号肽序列， 才能使表达的蛋白有活性才能使表达的蛋白有活性（六）表达的真核蛋白在原核中不稳定，易被细菌蛋白酶降解（六）表达的真核蛋白在原核中不稳定，易被细菌蛋白酶降解 二、真核克隆基因在大肠杆菌中的表达二、真核克隆基因在大肠杆菌中的表达（一）目的基因（一）目的基因 1、必须是、必须是cDNA 2、目的基因的上游是原核的、目的基因的上游是原核的S-D序列序列 3、去除、去除cDNA的启动子的启动子 4、对于分泌性蛋白，还应去除编码信号肽的序列、对于分泌性蛋白，还应去除编码信号肽的序列（二）载体（二）载体 所用载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌所用载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合聚合 酶所能识别的启动子和酶所能识别的启动子和S-D序列序列（三）真核基因在（三）真核基因在 E.coli中表达方式中表达方式 1、融合蛋白、融合蛋白(fusion protein)：是指表达的蛋白：是指表达的蛋白N端是原核基因端是原核基因 编码编码，C端是克隆的真核端是克隆的真核DNA编码编码其转录单位：其转录单位： 原核原核P S-D 原核结构基因原核结构基因 真核结构基因真核结构基因 转录转录 S-D mRNA 翻译翻译 N C 原核原核 真核真核 融合蛋白的优点：融合蛋白的优点： 1、稳定，不易被细菌蛋白酶降解、稳定，不易被细菌蛋白酶降解 2、可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化、可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化 3、原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白、原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白 二、真核基因在哺乳动物细胞中的表达二、真核基因在哺乳动物细胞中的表达 该真核基因可以是基因组该真核基因可以是基因组DNA，也可以是，也可以是cDNA 转染真核细胞可用磷酸钙共沉淀、电穿孔法、脂质体介导等转染真核细胞可用磷酸钙共沉淀、电穿孔法、脂质体介导等 3真核基因在其他表达系统中的表达真核基因在其他表达系统中的表达（一）昆虫表达体系（一）昆虫表达体系（二）酵母表达体系（二）酵母表达体系图8-7 寡核苷酸介导的定点诱变基本步骤