血红蛋白的提取和分离课件--高二下学期生物人教版选修1.pptx

思考：思考：1、血红蛋白为什么呈现、血红蛋白为什么呈现红色红色？2、一分子血红蛋白可携带几分子、一分子血红蛋白可携带几分子O2？3、一分子血红蛋白可携带几分子、一分子血红蛋白可携带几分子CO2？根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的的蛋白质。蛋白质。 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯内部有许多贯穿的穿的通道通道。琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用具有的大小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行分离。分离。相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢的通道，路程较长，移动速度较慢; ;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？会发生变性呢？ 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。磷酸缓冲液磷酸缓冲液, ,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N- -亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。 。由几条肽链组成。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此因此测定的结果只是测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩。因而掩盖了盖了，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤血血每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧一分子氧或一分子二氧化碳，或一分子二氧化碳，血红蛋白血红蛋白因含有因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。 去除去除杂蛋白杂蛋白，以利于后续血红蛋白的，以利于后续血红蛋白的分离纯化，分离纯化，洗涤次数洗涤次数不可过少。不可过少。1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心低速短时间离心3 3、吸取血浆：上层、吸取血浆：上层透明透明的的黄色黄色血浆。血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯的氯化钠溶液洗涤化钠溶液洗涤( (生理盐水生理盐水) )。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。表明洗涤干净。（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）（2）血红蛋白的释放）血红蛋白的释放阅读思考：阅读思考：1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1. 蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。2. 加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？将搅拌好混合液转将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。第第1 1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第第2 2层（中上层）：脂溶性物质层（中上层）：脂溶性物质沉淀层沉淀层（白色）；（白色）；第第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色) )；第第4 4层（最下层）：杂质层（最下层）：杂质沉淀层沉淀层（暗红色）。（暗红色）。用滤纸用滤纸过滤过滤，除去脂溶性沉淀层，于，除去脂溶性沉淀层，于分液分液漏漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。 除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。