纳米材料安全性的研究进展.doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date纳米材料安全性的研究进展纳米材料安全性的研究进展纳米材料安全性的研究进展摘要 人们对纳米材料的关注推动了纳米科学和技术的快速发展。随着纳米材料和纳米技术的迅速发展和广泛应用, 人们接触不同种类的纳米材料的机会大大增加. 有超过500种消费品宣称采用了纳米技术,每年市场需求成吨的纳米原材料,包括纳米金属、纳米氧化物和碳纳米管,对纳米医药产品的需求每年以17%速度在增长,到2011 年市场规模估计有530亿美元,其中药物市场最大,在2014年可达到180亿美元。目前至少有12种纳米药物已获得批准。在生产和使用过程中,纳米材料通过多种途径释放到环境、生态系统、水源和食品供应中,并进入人体。纳米材料与人体接触会不会引起不良的后果? 纳米材料对环境是否有危害? 当纳米材料和纳米技术与人类的关系越来越紧密的时候, 其引起的伦理学、社会和法律问题也越来越引起人们的关注. 本文就纳米安全性研究, 结合国内外各研究机构的实验结果和流行病学调查资料, 从纳米材料本身的安全性、纳米材料的生物效应、纳米材料毒性的体外评价3个方面, 简要阐述如何正确认识纳米材料和纳米技术的安全性. 关键词 纳米材料 安全性 毒性 生物效应 物质到纳米尺度(0.1100 nm, 1 nm= 109 m)后会出现特殊性能, 这种既不同于原来组成的原子、分子,也不同于宏观物质的材料即为纳米材料. 纳米材料尺寸小, 可轻易进入到生物体内, 这就为构建药物运输系统或者肿瘤的治疗提供了巨大的优势. 但是, 纳米材料作用于人体会不会引起不良的后果? 纳米材料对环境是否有危害? 当纳米材料和纳米技术与人类的关系越来越紧密的时候, 其引起的伦理学、社会和法律问题也越来越引起人们的注意. 随着社会学家对这些问题的理论阐述日益完善, 公众对纳米技术的理解也越来越深入1. 本文就纳米材料和纳米技术安全性研究的发展做一初步的总结与探讨.1 纳米材料本身的安全性纳米材料的尺寸大小、化学组成、表面结构、溶解性、形状以及聚集状态等均可以影响其生物学效应. 同时, 纳米材料的暴露途径也是一个重要的影响因素. 这些参数会影响其细胞内吞、细胞内的转运和定位、与蛋白的结合、体内的迁移和蓄积, 从而可能会引起特定的生物学反应. 迄今为止, 许多实验组对多种纳米材料的安全性进行了研究. 但是目前得到的实验结果并不相同甚至相互矛盾, 纳米材料的安全性还无法得到明确的结论. 而且它们进入到体内后的归宿如何、作用如何等等问题尚待解决. 所以,不能说纳米材料绝对的安全或危险, 要得到确切的结论还需要进行大量的后续研究. Braydich-Stolle 等人2利用小鼠精原干细胞作为模型评价纳米材料的毒性, 发现与相对应的可溶性盐相比, 所有类型的纳米颗粒均表现出显著的毒性,并具有剂量依赖性. 银纳米颗粒毒性最强, 三氧化钼 (MoO3)毒性最低. Goodman 等人3对核心为2 nm 的金纳米颗粒研究发现: 带正电荷的金颗粒具有中度毒性, 而带负电荷的金颗粒相对无毒; 高浓度的金颗粒有毒性. 体外肺腺癌上皮细胞的毒性实验4表明:多壁碳纳米管、碳纳米纤维和碳纳米颗粒均具有尺寸依赖的细胞毒性, 而其表面经过功能化修饰后, 细胞毒性增强.但是也有研究结果显示纳米材料并无明显的毒性. Derfus 等人5发现以CdSe 为核的量子点在某些条件下对原代肝细胞具有急性毒性, 其毒性可以通过改变合成参数、紫外暴露和表面包被等方法进行调控. 通过适当的表面修饰, 量子点的毒性大大降低,甚至变得无毒, 可广泛应用于细胞迁移的追踪和各种体外识别. 表面包被的量子点会影响人类基因组中很少量的基因, 即使量子点浓度达到超过人体常规剂量1000 倍以上, 也仅仅会影响基因组的0.2%6.硅、硅/氧化铁和金纳米颗粒对大肠杆菌的生长和活性没有表现出显著的毒性. 尽管体外实验存在一定的局限性, 但也可以说明纳米颗粒在某些条件下是相对安全的7. 2纳米生物效应随着纳米颗粒对人体健康、生存环境和社会安全等方面潜在的负面影响的发现,诸多纳米材料的生物效应研究方面取得了令人瞩目的成果。2. 1 纳米粒与细胞相互作用纳米颗粒能够进入细胞并与细胞发生作用,主要是对跨膜过程和细胞分裂、增殖、凋亡等基本生命过程的影响和相关信号传导通路的调控,从而在细胞水平上产生生物效应。庞小峰等人发现纳米氧化钛游离于细胞之间,阻碍了胞间通信,降低细胞的生长速度8 。2006年,北卡罗来纳州美国环境保护署神经毒物学家研究发现,纳米TIO2 粒子可被小鼠小神经胶质细胞吸收,在2 h 内释放出大量的活性氧化分子,表明大量的纳米粒子可能对生物体的神经细胞造成损伤。2006 年11 月美国环保局宣布:严格管理消费产品中使用纳米银粒子技术杀灭细菌,避免产品中包含的纳米银粒子能杀死环境中的有益菌和水中的生物,甚至对人体构成威胁911 。2. 2 纳米粒与生物大分子的相互作用许海燕等人发现纤维蛋白原分子有比较强的吸附作用,吸附上的纤维蛋白原分子构型功能发生了某些改变。纳米结构物质与补体系统和免疫细胞激活作用研究说明,纳米颗粒与蛋白质分子之间存在着较强的相互作用,使补体蛋白分子的酶活性发生改变12 。2. 3 大气中纳米粒的生物效应临床实验研究发现7100nm 的粉粒在人体呼吸系统内有很高的沉积率;粉粒越小、越难以被巨噬细胞清除,而容易向肺组织以外的组织器官转运,超细粉粒可穿过血脑屏障13 。2. 4 单壁纳米碳管(SWNTs) 诱发多发性肉芽瘤2003 年,美国杜邦公司用气管滴注法研究SWNTs 对大鼠肺部的毒性,发现SWNTs 诱发了多发性肉芽瘤,在美国宇航局太空中心研究中也出现类似的研究结果。2. 5 对肺细胞有害2006 年,英国爱丁堡大学科研人员在模拟汽车尾气以及涂料、防晒霜、食品、化妆品和服装等日用品中应用的纳米粒子,对人类肺部影响的实验中发现,纳米粒子会通过肺部隔膜进入肺部,并且进入血液中,而血液中的粒子最终会进入肺部和其它器官中。研究发现,纳米粒使肺泡巨噬细胞的趋化能力增高而吞噬能力降低,这样就使肺泡中的纳米颗粒物不能被巨噬细胞清除,而在肺泡中长期存在,从而产生慢性炎症反应。这种巨噬细胞趋化能力的增强加重了肺部炎症4 ,14 。2. 6 引起心血管疾病研究发现在生理盐水溶液中的100nm 以下的磁性纳米颗粒,仅仅微克量级进入小鼠血管就能很快导致凝血现象以致堵塞血管,导致小鼠死亡。提示这种纳米粒容易与心血管系统相互作用,可能有导致血管疾病的潜在危险6 。纳米粒引起心血管疾病的机制还不是很清楚,但一般认为纳米粒主要通过下列途径引起心血管疾病: (1) 纳米粒引发炎症,改变血液的凝固性,使冠状动脉性心脏病发病率升高。(2) 纳米粒可以从肺部进入到血液循环,与血管内皮相结合,从而形成血栓和动脉硬化斑。(3) 由于纳米粒能够进入中枢神经系统,所以一些心血管效应可能是一种自主反射1516 。2. 7 纳米粒毒性测试2006 年4 月,瑞士专家首次将数种不同类型的纳米微粒与已知的部分有毒和无毒物质进行比较,发现某些纳米微粒毒性惊人。其中测试纳米微粒对人体和啮齿动物细胞的影响发现,适度可溶纳米微粒对毒性有着极为灵敏的反应。2. 8 脑损伤Block 等用纳米级的柴油机废气颗粒物(DEP)与神经元细胞共同培养,发现DEP 具有选择性的多巴胺能神经元毒性。多巴胺神经元抗氧化能力较弱,最先受到了损伤,提示纳米粒可能是促进帕金森病发生发展的一个环境因素1718 。3 纳米材料毒性的体外评价3.1纳米材料的理化评价方法评价纳米材料生物效应前,必须详细考察理化性质,包括供应来源、清洁程序、批间差异、溶液性质。3.1.1表面沾染及检测 生物材料表面沾染降低材料表面能,受热力学驱动。纳米材料的表面沾染较强,源自吸附、氧化、腐蚀、荷电或电子转移。纳米材料的表面稳定剂 (表面活性剂、立体或静电稳定剂)在生物系统中可脱落,或分布到血清蛋白或生物膜,同样带来毒性或相容性问题。脂多糖呈表面活性,易吸附于疏水表面,它的磷酸酯也能和正电表面结合。因此,内毒素 (主要是脂多糖)沾染可发生在多种纳米粒表面。稠环芳烃是致癌物,在空气中分布微量但很广泛。其他常见的实验室内表面沾染物包括易挥发性烃、泵用硅油、增塑剂、催化剂及纳米合成中残留的惰性合成试剂。简单水洗难以彻底清除沾染物。纳米材料表面沾染后在体内引起的生物反应可能比纯的相同材料更显著。纳米表面分析方法不多,表面沾染测定法包括飞行时间二级离子质谱、X射线光电子光谱、X射线荧光法、相关能量分散X射线分析和表面增强拉曼光谱法。 3.1.2粒径和聚集的测定 材料的高分散性和表面能易造成纳米粒聚集。粒径测定方法包括透射电镜( TEM ) 、扫描电镜 ( SEM) 、光学法、动态光散射(DLS) 、荧光极化法。TEM可观测纳米材料的形态、粒径分布和聚集程度,得到的粒径信息最准确,但需要超高真空条件和专门设备。TEM表现的粒子聚集不能代表原位聚集状态,因为样品制备过程通常涉及干燥。由于离子强度的增加和表面张力的影响,水溶性样品易发生粒子聚集。传统SEM也需要超高真空环境。环境扫描电镜(ESEM)容许样品在水性条件下扫描和成像。金属纳米粒子和纳米棒的光吸收和散射有粒径依赖性,但只有几种纯金属符合要求:铅、铟、汞、锡、镉、银和金,它们有自由电子,可呈现等离子体激发带。粒子平均粒径增大时,等离子体吸收峰强度逐渐降低,并向高波长发生红移。纳米粒子污染或修饰后粒径增大,吸收波长红移几纳米。DLS已广泛应用于直接测定溶液中粒子粒径,但很易受少量污染物影响。时间解析荧光偏振各项异性法也用于测定纳米粒子的粒径。粒子运动荧光偏振衰减时间与荧光和粒径(水动力学半径)有关。荧光偏振的衰减用于区分粒子或其结合物(如受体、膜、蛋白)与测定组分。未来此技术可能用于测定纳米粒子与细胞受体的相互作用,并阐明毒性机制。3.2体外生物学测试:细胞类型、选择和用法纳米材料进入体内后立即不断接触到复杂生理环境,包括数千种表面活性分子、各个组织中的多种细胞,以及具有反应活性的病理或炎性物质。纳米材料与蛋白和细胞的相互作用、产生的影响和可能的毒性都是评价和了解纳米材料相容性/毒性的关键,包括纳米材料的细胞摄取和处理、对细胞信号的影响、对膜的干扰、对细胞电子转移束的影响、细胞化学因子和活性氧(ROS)的产生、跨细胞作用和细胞间转运、基因调控、明显的毒性反应、潜在毒性以及细胞坏死或凋亡。一般测试方法是将传代细胞或原代细胞置于塑料培养皿,加或不加血清,一次性加入纳米材料,然后观察细胞反应。主要采用的细胞类型包括吞噬细胞、神经细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、红细胞和各种癌细胞。 3.2.1吞噬细胞 纳米材料毒性通常源于细胞摄取。白细胞、免疫调节细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞)和吞噬细胞(如单核细胞、巨噬细胞)接触纳米材料后产生吞噬作用,并引起细胞因子信号反应或产生ROS,它们可作为模型细胞评价纳米材料对细胞吞噬的早期反应。吞噬细胞主要来源于外周血单核细胞、腹腔或肺部巨噬细胞和骨髓转化单核细胞,如RAW26417, J77411, IC221, THP21, Jurkat,Mono,Mac26和NR8383。纳米材料基于细胞水平检测通常会尽量考虑相关性质的化学特征从而选择相应细胞,在培养基中模拟其体内环境。例如选用公认可代表吞噬细胞类型的永生性二代细胞株如THP21, RAW, J7,Mono,Mac 6或IC221细胞株,或选用肺巨噬细胞在体外模拟纳米材料在肺部的反应。3.2.2肝细胞和血细胞 纳米材料通过注射、口服或吸入进入血液循环后,会立刻接触到高浓度的血小板和红细胞,也会经常遇到过滤型细胞和单核巨噬细胞系统(又称网状内皮系统) ,包括枯否细胞和其他吞噬细胞。肝脏是清除血液循环中粒子的主要组织,起作用的是肝枯否细胞, 而非肝细胞。肝毒性细胞模型包括Hep2G和BRL3A。常用的细胞毒性检测手段如细胞形态、线粒体功能、乳酸脱氢酶的膜渗漏、还原型谷胱甘肽水平、ROS生成、线粒体膜电位都可以应用。其他相关细胞模型包括内皮细胞如牛主动脉血管内皮细胞(BAEC)和人脐静脉血管内皮细胞(HU2VEC) 、红细胞、血小板和白细胞。红细胞可模拟非吞噬条件的跨膜粒子运动。聚苯乙烯粒子 (200 nm, 78 nm) 、金纳米粒(25 nm)和二氧化钛纳米粒( < 200 nm)都能不依赖表面电荷进入红细胞,但超过200 nm的粒子或粒子团只能吸附于细胞外膜,不能进入胞内。血小板模型可展示粒子的血液毒性,包括血小板活化和聚集,有研究表明纳米材料加速了血栓大鼠模型血栓的形成。 3.2.3上皮/内皮细胞 上皮和内皮组织均具有细胞驱动性生理屏障特征,阻挡外来粒子通过皮肤、黏膜、消化道或血管壁进入体内。体外实验选用的上皮细胞应与体内上皮组织相似,均有黏蛋白细胞膜层、微绒毛、桥粒和片层体。细胞模型必须根据体外实验模拟的组织功能及预期结果将皮肤、口腔、胃肠、结肠、肺、鼻腔、肾和阴道上皮特征区分开来,作为模型评价材料上皮毒性常用的细胞株多为癌前期肺型上皮细胞,除此之外,还有MDCK (肾) 、HT21080、HT292182C1 (结肠)和HeLa (宫颈)细胞。体内的胃肠、鼻腔、口腔、尿道上皮细胞的典型特征是黏附蛋白的产生和组织包裹层,它们经常脱落和再生,从而影响粒子的黏附、捕获、摄取和聚集。鼻腔的黏附蛋白层比口腔或小肠的薄,但在体外实验中经常忽视这一点,而常用非黏附蛋白上皮细胞株(如Caco22)作为模型。杯状细胞,如MTX2E12细胞,可分泌黏液,常在肠摄取研究中作为黏液相互作用的细胞模型。黏附蛋白对细胞与粒子相互作用有影响,对于疏水和(或)带正电粒子,黏附蛋白化胃上皮细胞是体外粒子评价优选的细胞类型。内皮细胞位于体内各种血液管道,是粒子或其他成分从血液进入到外周组织的屏障,如血脑屏障严格限制外界物质进入脑内。不同血管的内皮细胞性质差异很大,因此体外评价中采用的内皮细胞模型也很多,但用于纳米粒的相对较少。内皮细胞衍生的二代变异细胞株包括COX27 (肾)和MS21 (胰腺) 。商业化的原生分离细胞如人动脉内皮细胞(HAEC) 、HUVEC和人微血管内皮细胞,已作为细胞模型用于评价血液系统中金属氧化物粒子所致内皮炎性反应和关节硬化。如,Al2O3纳米粒对HUVEC有毒性反应, Fe2O3 纳米粒在所测试的最高剂量对HAEC也无毒,但Y2O3 和ZnO纳米粒在高剂量可引起明显的炎性反应。人大动脉平滑肌已用于评价聚乳酸聚乙醇酸聚合物纳米粒的吸收率。 3.2.4肿瘤 细胞模型除常见的癌前期细胞外,各种致癌基因变异的癌细胞株如MSTO211H、HL60、WTK1、1321N1 和HeLa都已用于材料的体外评价。它们可用于预测癌症纳米治疗的疗效,如,N2(22羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物与多柔比星结合物和第4代聚酰胺树枝状聚合物2琥珀酸2紫杉醇结合物,都能被人卵巢癌细胞(A2780)摄取。3.3以细胞为基础的体外毒性检测细胞学检测是目前用于毒性评价、生物材料检测和环境材料接触检测的主要方法。尽管体外模型与体内观察之间常在相关性和可预见性上欠佳,但目前还没有从材料合成到动物模型的直接和理性的其他判断标准。细胞模型仍不失为一种评价材料质量和体内关系的有效的方法,体外检测方法已列入ISO10993。细胞检测的主要指标有5方面: ROS生成、细胞活力、细胞应激、细胞形态和细胞的粒子摄取。目前需要关注的一个问题是纳米材料在有血清还是无血清环境中进行细胞检测。无血清培养液简化了蛋白粒子作用的复杂程度。许多研究发现有血清蛋白时,纳米材料(如聚合物药剂或基因载体)不能有效的细胞递送,而只能采用无血清的条件,这带来体内外相关性和生物等效性问题。3.3.1活性氧生成 吞噬细胞是评价纳米材料毒性的主要细胞模型,多种细胞检测方法可评价吞噬细胞ROS的生成,但需注意,含炭黑和TiO2的ROS生成检测在非细胞条件下也能产生ROS。直接测定细胞介质中ROS的方法包括2 种基于荧光素类化合物的检测方法和电子顺磁共振( EPR) 。荧光素探针如2, 72二荧光素二乙酸盐和二氯二氢荧光素二乙酸盐被ROS氧化时会产生荧光,荧光强度与ROS浓度呈正相关。无论细胞存在与否, EPR均能有效测定自由基。测定方法为:在培养基或纳米粒溶液中加入一种针对羟基或超氧自由基的自旋捕获剂如5, 52二甲基212吡咯啉2N2氧化物,或自由基消耗自旋探针如42羟基22, 2, 6, 62四甲基哌啶氧,一定时间后,收集上清,涡旋,然后用EPR光谱仪分析。大多数细胞可利用内源性谷胱甘肽中和ROS,测定谷胱甘肽就可定量检测ROS。通过分析关键性氧化物也可定量测定ROS对细胞膜或DNA的损伤。 3.3.2细胞活力检测 细胞活力测定的重点是细胞代谢。以染料为基础的细胞活力测定方法,主要利用活细胞和死细胞通过比色法或荧光法对染料或酶转化染料的摄入、排出和转化差异区分和定量。方法涉及中性红、台盼蓝、L IVE /DEAD 系统、乳酸脱氢酶、甲臜(MTT、MTS、WST) 、阿尔玛蓝、考马斯蓝、ATP2荧光素发光、腺苷酸转化激酶释放、线粒体膜电位和硫喷妥。荧光激活细胞筛选法能够对细胞的存活、死亡、凋亡或坏死进行分类和定量,还能区别细胞周期动力学变化。其他细胞活力测定也都是路径敏感的,能展示凋亡细胞DNA 碎片和渗漏, 包括EL ISA、comet、Caspase Glo3 /7 , Hoechst2DNA 和TUNEL 检测。显微镜也可用于对细胞死亡定量分析,但更多的是定性分析。 3.3.3细胞应激检测 细胞应激检测是确定环境带来的细胞非致命损伤和细胞行为改变。基因/蛋白表达变化可由聚合酶链反应( PCR) 、免疫印迹法和总蛋白分析测得。定量实时PCR已经用于测定丙烷爆破生成的纳米粒对A549细胞毒性调控的基因表达。这些测定能阐释毒性对基因表达的影响和毒性机制。体内巨噬细胞对侵入的应答包括ROS突释以及巨噬细胞和辅助细胞在侵入部位的聚集。细胞因子蛋白的直接检测通常采用表面俘获免疫介导的三明治方法,如酶联免疫吸附( EL ISA) 。可溶性细胞因子的定量,应参考逆转录酶PCR测得的特异mRNA信息。胶体、粒子和纳米材料的细胞摄取过程一般有4种:吞噬、内涵体介导的内吞、巨胞饮和非内涵体介导的内吞。吞噬主要源于巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞,吞噬粒子大于500 nm,通常由粒子调理素作用触发。几乎所有细胞都能胞饮,通常发生在内涵体包裹的小窝部位,允许小于200 nm的粒子通过。巨胞饮是细胞膜内陷形成15m的空泡,经常发生于巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞,也是肿瘤细胞富集聚合物和大分子的主要机制(渗透和滞留增强EPR效应) 。吞噬能力可采用细胞对2m的胶体金或其他荧光示踪粒子的摄取来考察。受体介导的内化具有温度依赖性。内涵体介导_时间内很难认定此类药物能升高血压或加速动脉粥样硬化,抑制COX22而引起的促血栓效应可能是原因所在。NSA ID的风险性为剂量依赖性,与其药理作用一致。虽然我们承认非随机数据的局限性,这样的结果也应加以解释,而不是被忽视,尤其是这种风险性的产生很可能是机制性,而且临床试验也发现了类似问题19。4结论纳米技术的多学科交叉性使其研究受到许多挑战,包括细胞和组织毒性的阐述、评估和相关性。纳米安全性研究需要建立一套有效的、可信赖的实验方法。纳米材料安全性评价的最大挑战是目前缺少适合的方法直接考察在复杂生物系统中的纳米材料。动态生物系统中个别和集体效应很难准确评价、预测和建立模型。接触纳米材料后的急性和长期效应和危害也很难检测。因此,在纳米材料安全性研究中,需要多种测定技术20。参考文献1Currall S C. 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