2022年培养基验证 .pdf

1 培养基验证规程1. 目的本规程 用于验证培养基的适用性和灵敏度2. 适用范围微生物 实验室3. 责任者QC 负责人。4. 规程4.1 培养基的灵敏度检查A菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代） ，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10 104枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )CMCC(B) 63 501生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64 941 白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001黑曲霉(Aspergillus niger )CMCC(F) 98 003 B菌液制备1）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液的制备名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 7 页 - - - - - - - - - 2 接种金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中， 3035培养 1824 小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于 100 cfu（/50100cfu）的菌悬液（一般稀释至10-7） 。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。2）枯草芽孢杆菌菌液的制备接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤，3035培养 1824 小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100 cfu （/50100cfu）的菌悬液（一般稀释至10-5） 。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。3）生孢梭菌菌液的制备接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,3035培养 1824 小时，采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100 cfu （/50100cfu）的菌悬液。菌数测定用硫乙醇酸盐流体培养基试管法。4）白色念珠菌菌液的制备接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基,2328培养 2448小时，上述培养物采用液体培养物直接稀释法或细菌标准浓度比浊法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100 cfu （/50100cfu）的菌悬液（一般稀释至10-6） 。菌数测定用玫瑰红钠琼脂培养基平皿法。5）黑曲霉菌液的制备接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上,2328培养57天至大量孢子产生，加入35mL 含 0.05%(ml/ml)聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。 然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内， 采用细菌标准浓度比浊法，用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于 100 cfu（/50100cfu）的孢子悬液。孢子数测定用玫瑰红钠培养基平皿法。菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28，可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 7 页 - - - - - - - - - 3 C灵敏度试验：取每管装量为 12ml 的营养琼脂、营养肉汤、 SCDLP、Baird Parker、甘露醇发酵培养基， 分别接种小于 100cfu的金黄色葡萄球菌各2 只；12mL 的十六烷三甲基溴化铵琼脂、 SCDLP、明胶、绿脓素测定培养基、硝酸蛋白胨水接种小于100cfu 铜绿假单胞菌各2 只；12ml 硫乙醇酸盐流体培养基枯草芽孢杆菌，生孢梭菌各 2 只，培养 3 天，取每管装量为 9ml 的改良马丁培养基和玫瑰红纳琼脂培养基分别接种小于100cfu 的白色念珠菌，黑曲酶各2 支，另一支不接种作为空白对照，培养 5 天，逐日观察结果。D结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管菌生长良好，判断培养基的灵敏度检查符合规定。4.2 适用性检查4.2.1 试验步骤a 菌液制备：按稀释度101,102,103等依次类推稀释菌悬液，接种培养后取50100cfu计数。接种金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035，培养 1824小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上 2528，培养 2448小时，上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为 50100CFU 的菌悬液，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 2328，培养 57 天，加入 3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。 然后，吸出孢子悬液 （用管口带有薄的无菌棉花或纱布能通过滤菌丝的无菌巴氏吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50100cfu 的孢子悬液。菌液制备后在室温2h 内使用，在 28可再 24h 内使用。b适用性检查：接种金黄 色葡萄球菌 、大肠埃希 菌、枯草芽 孢杆菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾入营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，混匀，凝固，置3035培养 48h，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各 50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，混匀，凝固，置2328培养 72h，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 7 页 - - - - - - - - - 4 结果判定：若被检培养基上得菌落平均数不小于对照培养基上得菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上得菌落一致，判改培养基的适用性检查符合规定。4.2.2 验证方法验证试验至少应进行3 次独立的平行试验， 并分别计算个试验菌每次试验的回收率。a平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和 50100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌数。 薄膜过率法计数时， 取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。b菌液组测定所加的试验菌数。c 供试品对照组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。d稀释剂对照组若供试液制备需要分散、 乳化，中和、离心或薄膜过滤等待处理时， 应增加稀释剂对照组， 以考察供试液替代供试验品，加入试验菌， 使最终菌浓度为每 1ml 供试液含 50100cfu， 按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。表 1 微生物验证方法组数加样加样量（ mL）回收率（%）是否合格试验组供试液+菌液1 菌液组菌液供试品对照组供试液稀释剂对照组稀释液+菌液e结果判断在 3 次独立的平行试验中。稀释剂对照组的平均菌落数稀释剂对照的菌回收率 =100%名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 7 页 - - - - - - - - - 5 菌液组的平均菌落数试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数试验组的菌回收率 = 100%菌液组的平均菌落数各组回收率应均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数； 若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、 离心沉淀集菌法、 薄膜过滤法、 中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。结果判定：若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的 70%， 且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。5. 制定依据中华人民共和国药典2010版第二部附录 XI H 无菌检查法中国药品检验标准操作规范2010 年版 无菌检查法GB/T14233.3-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物学6. 附录附录 1：培养基灵敏度检查报告附录 2：培养基适用性检查报告附录 1：培养基灵敏度检查报告名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 7 页 - - - - - - - - - 6 菌种类型培养基培养条件温度时间阴性对照结论金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌生梭孢菌铜绿假单胞白色念珠菌黑曲霉检验人复核人日期备注：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 7 页 - - - - - - - - - 7 附录 2：培养基适用性检查报告菌种类型培养皿编号培养基培养条件对照培养基计数验 证 培 养 基计数结论金黄色葡萄球菌1 2 枯草芽孢杆菌1 2 生梭孢菌1 2 铜绿假单胞1 2 白色念珠菌1 2 黑曲霉1 2 检验人复核人日期备注：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 7 页 - - - - - - - - -