2022年2022年骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响[借 .pdf

中国组织工程研究第 20 卷 第 32 期20160805 出版Chinese Journal of Tissue EngineeringResearchAugust 5, 2016Vol.20, No.32P.O. Box 10002, Shenyang110180www.CRTER.org4798研究原著www.CRTER.org高明龙，男，1978 年生，山东省茌平县人，汉族，2003 年齐齐哈尔医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事老年痴呆及儿童精神和行为障碍研究。通讯作者：王金成，主治医师， 河北医科大学第一医院精神科，河北省石家庄市050031中图分类号 :R394.2文献标识码 :B文章编号 :2095-4344(2016)32-04798-07稿件接受： 2016-06-30骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响高明龙1，孙丽2，赵小川1，余明1，王金成1(1河北医科大学第一医院精神科，河北省石家庄市050031 ；2解放军第 260医院神经内科，河北省石家庄市050031)引用本文：高明龙，孙丽，赵小川，余明，王金成.骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响J.中国组织工程研究，2016，20(32):4798-4804.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.013ORCID:0000-0002-0545-594X(高明龙 )文章快速阅读：文题释义：海马神经再生： 神经再生是由神经前体细胞产生新神经元的过程。在成年哺乳动物的大脑内，嗅觉系统和海马是两个被广泛接受的具有成年神经再生能力的区域。其中，海马是与学习记忆有关的关键脑区，并在阿尔茨海默病中受损最为严重，海马的前体细胞在海马齿状回颗粒下区，这些细胞不断增殖，产生的新细胞迁移较短距离到颗粒细胞层，分化为颗粒细胞，并将轴突和树突投射到CA3 区和分子层，这些新生的细胞特性类似于成熟的神经元，可迁移到脑损害部位，并与周围神经元建立突触联系，从而补偿损伤神经元的功能， 这一神经再生过程在海马依赖性的学习记忆中起重要作用，有利于改善阿尔茨海默病的认知功能障碍。阿尔茨海默病模型：用于研究阿尔茨海默病的重要动物模型有自然衰老模型、A 注射诱导模型、基底前脑胆碱能系统损伤模型、慢性缺血痴呆模型、铝中毒模型、与Tau 蛋白过度磷酸化有关的痴呆动物模型、 复合动物模型、 转基因动物模型。实验采用给予大鼠灌胃三氯化铝的方式造模，此类模型虽然造模时间长，但更与人们的生活相似，且成功率高。摘要背景：临床上通过药物治疗老年性痴呆虽然在一定程度上可以缓解患者的症状，但效果甚微。 干细胞移植是对该疾病的一种新的尝试和探索。目的： 观察骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆大鼠行为学的影响。方法：选取 SD 大鼠 20 只，给予连续灌胃及饮食三氯化铝60 d 建立老年性痴呆大鼠模型，造模后随机分为模型组和实验组，实验组海马区注射骨髓间充质干细胞，模型组注射生理盐水，另取10 只大鼠正常喂养作为对照组。移植后4 周，通过 Morris 水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，取大鼠脑组织检测超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平。结果与结论：与模型组比较，实验组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P 0.05) ，跨越平台次数增加(P 0.05) ；与模型组比较，实验组大鼠脑组织中超氧化物歧化酶活性升高(P 0.05) ，丙二醛水平降低(P 0.05)；结果表明，骨髓间充质干细胞移植后能够改善老年性痴呆大鼠的学习记忆能力，有助于大鼠行为学的恢复。关键词：干细胞；移植；老年性痴呆；大鼠；骨髓间充质干细胞；海马；行为学；超氧化物歧化酶；丙二醛主题词：阿尔茨海默病；骨髓；间质干细胞移植；神经行为学表现；超氧化物歧化酶；丙二醛；组织工程基金资助：河北省计生委员会2014年度医学科学研究课题(ZL20140099)骨髓间充质干细胞移植治疗老年性痴呆正常组模型组实验组骨髓间充质干细胞移植后能够改善老年性痴呆大鼠的学习记忆能力，有助于大鼠行为学的恢复海 马 区 注 射骨 髓 间 充 质干细胞连续灌 胃及饮食 三氯化铝名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 7 页 - - - - - - - - - 高明龙，等 .骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响ISSN 2095-4344CN 21-1581/RCODEN: ZLKHAH4799www.CRTER.orgGao Ming-long,Master,Attending physician,Departmentof Psychiatry,First AffiliatedHospital ofHebei Medical University,Shijiazhuang050031,Hebei Province,ChinaCorrespondingauthor:Wang Jin-cheng,Attendingphysician, DepartmentofPsychiatry,First AffiliatedHospital of Hebei MedicalUniversity,Shijiazhuang050031, Hebei Province,ChinaEffectof bonemarrowmesenchymalstemcell transplantationon seniledementiabehaviorsGao Ming-long1, Sun Li2, Zhao Xiao-chuan1, Yu Ming1, Wang Jin-cheng1(1Departmentof Psychiatry,FirstAffiliatedHospitalof Hebei Medical University,Shijiazhuang050031, Hebei Province,China;2Departmentof Neurology,the 260thHospitalof ChinesePLA, Shijiazhuang050031,Hebei Province,China)AbstractBACKGROUND:Drug treatmentfor senile dementiahas unsatisfactoryoutcomesalthoughto a certainextent it can reduce and delay the progressionof Alzheimersdisease.Stem cell transplantationis a newattempt for the treatmentof senile dementia.OBJECTIVE:To observethe effect of bone marrow mesenchymalstem cell transplantationon thebehaviorof senile dementiarats.METHODS:Rat models of senile dementiawere made in 20 Sprague-Dawleyrats that were givencontinuous60-day gavageof aluminiumchloridesolution.Then, model rats were randomizedinto modelgroup treatedwith normalsaline injectionand experimentalgroup treatedwith hippocampalinjection ofbone marrow mesenchymalstem cells, respectively.Another 10 rats undergoingnormal feeding served ascontrol group. Learningand memoryability of rats were tested by Morris water maze, and superoxidedismutaseactivity and malondialdehydecontentin brain tissues of rats were measuredby colorimetricmethod at 4 weeks after cell transplantation.RESULTSAND CONCLUSION:Comparedwith the model group, the escape latency was shortenedandthe cross-platformfrequencywas increasedin the experimentalgroup (P 0.05), and moreover,significantlyelevatedsuperoxidedismutaseactivity and reduced malondialdehydecontentin the braintissues of rats were found in the experimentalgroup (P 0.05). These findingsindicatethat bone marrowmesenchymalstem cell transplantationcontributesto behaviorimprovementin senile dementiarats byimprovingthe learning and memoryability.Subjectheadings:AlzheimerDisease;Bone Marrow; MesenchymalStem Cell Transplantation;NeurobehavioralManifestations;SuperoxideDismutase;Malondialdehyde;Tissue EngineeringFunding:the 2014 Medical ResearchProject of Health and Family PlanningCommissionof HebeiProvinceof China, No. ZL20140099Cite this article:Gao ML, Sun L, Zhao XC, Yu M, Wang JC. Effect of bone marrow mesenchymalstem celltransplantationon senile dementia behaviors. Zhongguo Zuzhi GongchengYanjiu. 2016;20(32):4798-4804.0引言Introduction老年性痴呆是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，严重影响老年人的身心健康，给患者家属及社会带来严重影响1。此病的主要临床症状为记忆障碍、失认、视空间技能损伤、执行功能障碍以及人格和行为改变等，随着病情的不断恶化，最终会导致行为紊乱和个性的全面性痴呆，对于此病的病因病机至今尚不清楚2-7。老年性痴呆与年龄密切相关，临床研究显示是一种不可逆的神经系统多功能退行性疾病1。此病在老年群体中表现出的主要特点为：发病率高、患病率高以及致残率高等8-9。老年性痴呆的致病因素、病因、 病机及病理复杂，临床治疗只能暂时缓解患者的症状，还没有完全根治的有效治疗方案，并不能有效阻止患者病情的进一步发展。近年来研究发现，骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力，能够分化为神经系统中的各类细胞，对受损的神经组织具有一定的修复功能，成为目前科学研究中最具潜力和价值的细胞10-13。实验观察骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆SD 大鼠生活状态及学习记忆、认知功能恢复的影响。1材料和方法Materialsand methods1.1设计随机分组对照动物实验。1.2时间及地点于 2014 年 2月至 2015 年7月在河北医科大学第一医院实验室完成。1.3材料1.3.1实验动物选取健康雄性SD大鼠 30 只， 2月龄，体质量 (20020) g，SPF 级，采购于上海交通大学医学院实验动物中心，合格证书号为SCXK( 沪)2013-0073 ，购回后于温度(252)、湿度 (505)%环境下适应性喂养1周。另选取雄性 SD 大鼠 5只，体质量 (14010)g，用于骨髓间充质干细胞的分离培养。实验过程中对SD大鼠的处置均符合2006 年中华人民共和国科学技术部颁布的关于善待实验动物的指导性意见标准14。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 7 页 - - - - - - - - - 高明龙，等 .骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响P.O. Box 10002, Shenyang110180www.CRTER.org4800www.CRTER.org1.3.2主要设备FACSCalibur流式细胞仪(美国 BD公司 )，KDC-2046低速冷冻离心机(杭州汇尔仪器设备有限公司)， BPH-9042CO2恒温细胞培养箱(上海一恒)。1.4实验方法1.4.1老年性痴呆大鼠模型的建立15-17取 20只 SD 大鼠给予三氯化铝溶液造模，前 2个月每天给予400 mg/kg的量， 之后给予含 1.5 g/L 三氯化铝的饮用水让大鼠自由饮水，正常对照组SD 大鼠给予等量的蒸馏水灌胃及饮用，于造模 2个月后， 采用 Morris 水迷宫实验检测大鼠的学习记忆改变情况。1.4.2骨髓间充质干细胞的分离培养取 5只体质量(140 10) g的雄性 SD 大鼠， 断颈法处死， 在无菌操作台上分离出股骨及胫骨，除去表面附着的软组织及肌肉，用DMEM 培养液冲洗 3次，剪去骨骺端，用骨髓间充质干细胞标准培养液冲洗， 冲出的细胞悬浮液于低温条件下，以2 000 r/min 离心 5 min ，弃去上清液，轻轻加入淋巴细胞分离液上层， 以3 000 r/min 离心 15 min，取界面单个核细胞层， 用磷酸盐缓冲液润洗2次， 以2 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，加入骨髓间充质干细胞培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度约5.0107L-1接种于培养瓶(含高糖DMEM 培养基 +体积分数为 10% 胎牛血清 )，置 37 、体积分数为 5%CO2培养箱，观察细胞形态变化，培养2 d时用 0.25% 胰蛋白酶- EDTA 消化，制成单细胞悬液，以细胞浓度约为 5.0107L-1接种进行传代。第3代细胞培养到第 3天时，用 BrdU 标记骨髓间充质干细胞30 min ，在培养箱中继续培养72 h，使用胰蛋白酶消化，以 1 500 r/min离心 5 min ，细胞计数仪调整细胞浓度约为1.01010L-1移植备用。取部分细胞使用流式细胞仪检测CD44 ，CD90 ，CD105 和CD45 表面标志表达。1.4.3分组老年性痴呆 SD 大鼠建模成功后，随机分为2组：模型组、实验组，每组10 只。另取 10只正常 SD大鼠为对照组，不做任何处理。实验组大鼠造模成功第2周，进行骨髓间充质干细胞移植，移植部位依照大鼠脑立体定位图谱，用微量注射器(量程 10 L) ，将含约1.0105个骨髓间充质干细胞的悬浮液立体定位注入SD大鼠双侧海马区，两侧各移植细胞数约为1.0 105(10 L) ，注射速度约为1 L/min，注射完毕后停留4 min；模型组造模后第2周在大鼠海马区注入等量的生理盐水。移植成功后，给予普通大鼠饲料正常喂养4周进行 Morris 水迷宫行为学检测。1.4.4Morris 水迷宫学习记忆力测试18实验测试包括2个部分：空间探索实验和定位航行实验。定位航行实验：按照随机的原则分别从不同的象限将SD 大鼠从池壁放入水中，记录SD 大鼠从入水到寻找到平台的轨迹线路以及花费的时间即是逃避伏期。寻找到平台休息20 s后，进行下一步的测试。如果大鼠在 100 s内未找到平台，将大鼠牵引至平台，并停留30 s，则大鼠逃避潜伏期记录为100 s；定间探索实验：SD 大鼠从池壁放入水中，记录大鼠在2 min 内的运行轨迹以及穿越平台的次数。1.4.5大鼠脑组织中丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性测定水迷宫行为学检测完成后，乙醚麻醉，采取颈椎脱臼法处死所有大鼠，在冰上分离出脑组织，称质量，取一部分脑组织，采用硫代巴比妥酸化学比色法检测脑组织中丙二醛水平，采用黄嘌呤氧化酶法检测脑组织中超氧化物歧化酶活性，具体操作方法按照试剂盒的详细说明操作。1.4.6大鼠脑组织病理学检查取剩余部分脑组织放入含有 40 g/L 多聚甲醛的磷酸盐缓冲溶液的标本储存瓶中，在固定液中放置24 h以上，再进行完全脱水处理，石蜡包埋，病理切片机切片，进行苏木精- 伊红染色。1.5主要观察指标各组大鼠体质量；各组大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数；各组大鼠脑组织丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性；各组大鼠海马移植部位病理变化。1.6统计学分析实 验 数 据 符 合 正 态 分 布 ， 采 用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以_x s表示，组间比较釆用t 检验， P 0.05) ；在应激造模的第 15，30，60天，与对照组大鼠比，造模SD大鼠平均体质量偏低，差异有显著性意义(P 0.05) ；骨髓间充质干细胞移植后1，2，3，4周，实验组体质量明显高于模型组，差异有显著性意义(P 0.05) ，造模第 15天，对照组及造模组大鼠逃避潜伏期均明显下降，第30-60 天，与对照组相比，造模组的逃避潜伏期均明显较长，差异有显著性意义(P 0.05) 。移植 1，2，3，4周，实验组与模型组比较，实验组平均逃避潜伏期迅速下降，差异有显著性意义(P 0.05) ，同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于对照组，见 表4。2.4各组大鼠 Morris 水迷宫跨越平台检测结果与对照组相比，造模成功后SD 大鼠跨越平台次数明显减少，差异有显著性意义(P 0.05) ；骨髓间充质干细胞移植后1周，模型组 SD 大鼠跨越平台次数并没有显著变化，对照组大鼠跨越平台次数略有增加，模型组与对照组比差异有显著性意义(P 0.05) ；实验组与模型组比较，跨越平台次数明显增多，差异有显著性意义(P 0.05) ，但跨越平台次数仍低于对照组，与对照组比较，差异也有显著性意义(P 0.05) ，见 表5。2.5各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性及丙二醛水平与对照组比，模型组大鼠脑组织中超氧化物歧化酶活性显著降低(P 0.05) ，而丙二醛水平却明显升高(P 0.05) 。骨髓间充质干细胞移植后，与模型组比较，实验表 1应激性造模过程中大鼠体质量变化(_x s，g)Table 1Body mass changes in rats before and aftermodeling表注：与对照组比较，aP 0.05 。时间对照组 (n=10)造模组 (n=20)第 1 天215.1110.56218.7311.12第 15 天279.7220.68241.5716.41a第 30 天342.1514.27285.0613.73a第 60 天371.3717.24316.4416.82a表 2骨髓间充质干细胞移植后各组大鼠体质量变化(_x s，n=10，g)Table 2Changesof body mass in rats after bone marrowmesenchymalstem cell transplantation表注：与模型组比较，aP 0.05 。时间对照组模型组实验组0 周371.37 17.24317.41 15.21315.69 16.331 周383.14 16.53330.62 17.88341.47 14.94a2 周395.82 17.47358.23 18.56371.35 13.81a3 周409.46 13.25372.66 17.01389.41 13.52a4 周415.61 10.74381.58 18.43400.33 12.54a表 3应激性造模过程中大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期(_x s，s)Table 3Comparisonof the escape latency of Morris watermaze in rats during modeling表注：与对照组比较，aP 0.05。时间对照组 (n=10)造模组(n=20)第 1天36.216.3638.018.33第 15 天12.564.2129.452.26a第 30 天8.153.1122.433.03a第 60 天7.212.4820.633.47a表 4骨髓间充质干细胞移植后各组大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期(_x s，n=10，s)Table 4Comparisonof the escape latency of Morris watermaze in three groups of rats after transplantation表注：与模型组比较，aP 0.05 。时间对照组模型组实验组0 周7.21 2.4819.88 3.4421.67 4.181 周6.73 2.5720.24 5.9117.33 4.12a2 周6.52 2.9922.61 6.9413.70 5.61a3 周6.06 4.9423.73 5.089.44 3.75a4 周6.44 2.5125.07 6.448.08 3.91a表 5移植前后各组SD 大鼠跨越平台检测结果比较(_x s，n=10)Table 5Comparisonof cross-platformfrequencyof ratsbefore and after transplantation表注：与对照组比较，aP 0.05 ；与模型组比较，bP 0.05 。组别造模后治疗后对照组6.831.067.102.31模型组1.890.87a1.75 1.11a实验组1.970.525.731.24b表 6各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性及丙二醛水平(_x s，n=10)Table 6Comparisonof superoxidedismutaseactivity andmalondialdehydecontent in the brain tissue of rats表注：与对照组比较，aP 0.05；与模型组比较，bP 0.05。组别超氧化物歧化酶 (U/mg)丙二醛(mol/g)对照组278.1758.2315.574.85模型组201.1355.19a26.81 5.32a实验组269.7751.25b18.34 4.24b名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 7 页 - - - - - - - - - 高明龙，等 .骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响P.O. Box 10002, Shenyang110180www.CRTER.org4802www.CRTER.org组脑组织中超氧化物歧化酶活性升高(P 0.05) ， 丙二醛水平减少 (P 0.05) ，与对照组大鼠脑组织中超氧化物歧化酶活性及丙二醛水平相近，见表6。2.6体外培养的骨髓间充质干细胞形态分离培养 4 h细胞即开始逐渐贴壁，由圆形逐渐变为长梭形(图1)。经流式细胞仪检测CD44 、CD90 和CD105 细胞表型呈阳性表达， CD45 细胞表型呈阴性表达(图2)，所分离出的细胞符合骨髓间充质干细胞的形态及表面标志物等特性，具有较好的自我更新能力和多向分化潜能，证实分离所得细胞为骨髓间充质干细胞。2.7各组大鼠海马移植部位病理形态学观察对照组大鼠海马细胞结构完整、边缘清晰， 细胞层厚、 密度大，且排列整齐、紧密(图3A )；模型组大鼠海马细胞结构不完整、与对照组比有大量细胞缺失，细胞层变薄，间隙增大，排列紊乱、疏松(图3B )；实验组骨髓间充质干细胞移植 4周后，大鼠海马组织结构基本完整，与模型组比，细胞层增厚，排列整齐(图3C )。3讨论Discussion老年性痴呆又称为阿尔茨海默病，是一种与年龄密切相关，且表现为不可逆性的退行性神经系统疾病1。国内外研究显示，老年性痴呆患者通常伴有行为学障碍，主要集中在注意力下降、记忆功能减退、精神运动学障碍、 信息处理障碍， 导致患者不能正常思考和判断，必须由家属照料日常生活等。随着社会的老龄化进程，老年性痴呆患者会越来越多，给社会及患者家属带来沉重的社会和经济负担。老年性痴呆的主要临床症状为记忆障碍、失认、视空间技能损伤、执行功能障碍以及人格和行为改变等，随着病情的不断恶化，最终会导致行为紊乱和个性的全面性痴呆，对于此病的病因病机至今尚不清楚。老年性痴呆所涉及的复杂病理、生理目前还没有彻底研究清楚。由于老年性痴呆的发病过程与衰老有密切相关，而患者的病理生理变化及发生发展的过程，动物是不能完全取代的。因此，老年性痴呆动物模型只能模拟部分特征， 常见的动物模型有自然衰老模型、A注射诱导模型19-20、 基底前脑胆碱能系统损伤模型(包括手术损伤模型、化学损毁模型)21、慢性缺血痴呆模型22、铝中毒模型、 与 Tau 蛋白过度磷酸化有关的痴呆动物模型23-24、复合动物模型25、转基因动物模型26。图 2流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型Figure 2Immunophenotypedetectionof bone marrowmesenchymalstem cells using flow cytometry图注：体外培养的骨髓间充质干细胞经流式细胞仪检测CD44 、CD90 和 CD105 细胞表型呈阳性表达(A- C)，CD45 细胞表型呈阴性表达(D)。图 3各组大鼠海马移植部位病理形态学观察(苏木精 -伊红染色， 200)Figure 3Pathomorphologicalobservationof the rat hippocampusin differentgroups (hematoxylin-eosin, 200)图注：图中A 为对照组大鼠海马细胞结构完整、边缘清晰，且排列整齐；B 为模型组大鼠海马细胞结构不完整、与对照组比有大量细胞缺失，排列紊乱； C 为实验组大鼠海马组织结构基本完整，细胞层增厚，排列整齐。ABC图 1体外培养的SD 大鼠骨髓间充质干细胞(100)Figure 1Bone marrow mesenchymalstem cells from Sprague-Dawleyratscultured in vitro ( 100)CD44CD90CD105CD45名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 7 页 - - - - - - - - - 高明龙，等 .骨髓间充质干细胞移植对老年性痴呆行为学的影响ISSN 2095-4344CN 21-1581/RCODEN: ZLKHAH4803www.CRTER.org实验采用给予大鼠灌胃三氯化铝的方式造模，此类模型虽然造模时间长，但更与人们的生活相似，所以科学合理，且成功率高，符合实验的要求。给予SD 大鼠连续灌胃及饮食三氯化铝60 d，多项指标显示大鼠精神萎靡，行为活动下降，与对照组相比，模型大鼠体质量显著下降 (P 0.05) ，逃避潜伏期明显延长(P 0.05) ；细胞移植后1，2，3，4 周，实验组体质量明显高于模型组，差异有显著性意义 (P 0.05) ，实验组大鼠体质量越来越接近于对照组大鼠；与模型组比较，实验组大鼠脑组织中超氧化物歧化酶活性升高，丙二醛水平下降，说明骨髓间充质干细胞移植后可间接或直接改善自由基在大鼠体内的代谢，从而促进老年性痴呆大鼠行为学改善。实验使用骨髓间充质干细胞作为治疗载体对老年性痴呆进行治疗，通过动物实验证实了该种疗法有效并且安全，有力支持了干细胞治疗手段的发展。作者贡献 ：第一作者负责设计和实施，第二、三、四及通讯作者负责实施及文章的修改。利益冲突 ：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题 ：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation 相关动物伦理学标准的条例。文章查重 ：文章出版前已经过CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查重。文章外审 ：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明 ：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库 )记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权 ：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4参考文献References1Howard KL, Filley CM. 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