2022年特定基因表达水平的检测借鉴 .pdf

特定基因表达水平的检测（试剂制备、操作步骤和注意事项）2010-01-10 23:19:59 来源： 易生物实验浏览次数： 192 网友评论0 条Northern 杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来， 随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA 或 RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。关键词： 基因表达RNA -gel blot analysis 或 Northern Blot继分析 DNA 的 Southern 杂交方法出现后，1977 年 Alwine 等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA 或含 poly A 尾的 RNA 样品中特定 mRNA 分子大小和丰度的分子杂交技术， 这就是与Southern 相对应而定名的Northern 杂交技术。 这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA 最为常用的经典方法。与 Southern杂交相似， Northern 杂交也采用 琼脂 糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来， 随后将其原位转移至固相支持物（如 尼龙膜 、硝酸纤维膜等） 上，再用放射性 （或非放射性）标记的DNA 或 RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。但与Southern杂交不同的是，总RNA 不需要进行酶切，即是以各个RNA 分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA 水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern 也可检测目标mRNA 分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。一、试剂准备（易生物试剂购销平台 EDTA : EDTA16.61g 加 ddH2O 至 80ml, 调 pH 至 8.0, 定容至 100ml 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - 2、50mM NaAc: NaAc 3.4g 加 ddH2O 至 500ml, 加 DEPC 0.5ml, 振荡 , 37过夜，高压灭菌。3、5 甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS3-(N- 玛琳代 )丙磺酸 10.3g 加 50mM NaAc 400ml, 用 2N NaOH 调 pH 至 7.0, 再加入 0.5M EDTA 10ml, 加 DEPC H2O 至 500ml 。 无菌抽滤，室温避光保存。4、20 SSC: NaCl 175.3g 、柠檬酸三钠88.2g ，加 ddH2O 至 800ml ，用 2N NaOH 调 pH至 7.0，再用 ddH2O 定容至 1000ml 。DEPC 处理、高压灭菌。5、6 SSC: 20 SSC 300ml 加 ddH2O 至 1000ml 。DEPC 处理 ,高压灭菌。6、50 Denhardt : 聚蔗糖 0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g 、牛血清 白蛋白 (BSA)0.5g加 dd H2O 至 50ml, 无菌抽滤、分装。7、1M Na2HPO4: Na2HPO4?12H2O 35.81g, 加 dd H2O 至 100ml 。8、1M NaH2PO4: NaH2PO4?2H2O 15.6g, 加 dd H2O 至 100ml 。9、0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO435.2ml 加 NaH2PO464.8ml 。10、STE 缓冲液 : 1M Tris -HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml ，加 dd H2O 至 250ml 。11、预杂交液 : 20 SSC 5ml, 甲酰胺 10ml,50 Denhardt 4ml,1M 磷酸钠缓冲液0.2ml （pH6.6）,10% SDS1ml, 总体积20ml 。临用前加入变性鲑鱼精DNA （10mg/ml ）,使终浓度为4l/ml 。12、DEPC H2O: 1000mldd H2O 中加入 DEPC 1ml ，充分振荡，37过夜，高压灭菌。二、操作步骤1、总 RNA 提取：见相关内容。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - 2、 变性胶的制备：取琼脂 糖 0.2g ，加入 DEPC H2O 12.4ml ，加热熔化，于保温状态下加入 5 甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml 、37% 甲醛 3.6ml ，混匀、制胶。待胶凝固后，置1 甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min 。3、样品制备：取总RNA 4.5 l( 约 20-30g) ，加入 5甲醛凝胶电泳缓冲液4.0 l、37% 甲醛 3.6 l、甲酰胺 10l，65温育 15min 、冰浴 5min 。加入 EB（1g/ l）1l、上样缓冲液2l。4、电泳：上样，50V 电泳（电泳时间约2hr 左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA 的完整性，记录18S 、28S 条带的位置（离加样孔的距离）。特定基因表达水平的检测（试剂制备、操作步骤和注意事项）2010-01-10 23:19:59 来源： 易生物实验浏览次数： 193 网友评论0 条Northern 杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA 分离开来， 随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA 或 RNA 探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA 所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA 在所测样品中的相对含量（即目标RNA 的丰度）。关键词： 基因表达5、将 RNA 从变性胶转移到硝酸纤维素膜 或 尼龙膜 ：（1）用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张 Whatman 3MM 滤纸 ，倒入 20SSC 使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM 滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。（2） 将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM 滤纸中央， 3MM 滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。（3）用 Parafilm 膜围绕凝胶四周， 以此作为屏障， 阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。（4）在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - （5） 将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM 滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。（6） 将一叠（ 5-8cm 厚）略小于3MM 滤纸的纸巾置于3MM 滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500 克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA 并使其聚集在膜上。6、使上述 RNA 转移持续进行15hr 左右。 在转膜过程中， 当纸巾浸湿后， 应更换新的纸巾。7、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM 滤纸。将膜在6 SSC 中浸泡 5min ，以去除膜上残留的凝胶。8、将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA 。9、膜置 80，真空干烤1-2hr 。烤干后的膜用塑料袋密封，4保存备用。10、探针标记 (Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司 )：（1） 取模板 DNA 25ng 于 0.5ml 离心管 中， 95-100 变性 5min ，冰浴 5min 。（2） dNTPmix的制备 : 取 dGTP 1l、dATP 1l、dTTP 1l 混匀。（3）将下列反应成份混合，加入上述微量离心管 中：dNTPmix 2.0 lBSA(10mg/ml ) 2.0 l5buffer 10.0 lKlenow 酶(5u/ l) 1.0 l -32P-dCTP 5.0 l加入适量dd H2O 使反应总体积达50l，轻轻混匀。室温下反应1hr 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - 11、预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42预杂交3hr 。12、杂交：将变性的探针（95-100 变性 5min ，冰浴 5min ）加入到预杂交液中，42杂交 16hr 。13、洗膜：（1）倾去杂交液。（2）2 SSC/0.1% SDS 室温洗 15min 。（3）0.2 SSC/0.1%SDS，55洗 15min2 次。14、压片：将膜用dd H2O 漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X 光片。暗盒置-70放射自显影37 天左右。三、注意事项1、操作时必须仔细、小心，严格按同位素 操作规程进行，以防止同位素 污染。2、必要时，可采用Sephades G-50 柱层析法纯化标记的探针（见本节附录），以去除标记反应中未结合的（游离的）核苷酸 。3、膜的重复使用：结合了待测RNA 的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下：杂交的膜（注意：杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置100 0.5% SDS 中煮沸 3min ，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3 遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。易生物实验 技术频道- 生物实验技术资料库！http:/名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - -