最新单细胞凝胶电泳精品课件.ppt

单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis, SCGE) ，也称彗星试验(comet assay) ，是Ostling O和Johanson KJ首次提出，后经Singh等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测DNA损伤、交联和修复的方法。因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学调查等诸多方面。 第二层胶：取50L 质量分数为0.8%的低熔点琼脂糖（LMA）和30L的细胞悬液，混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使其均匀铺开，4凝固10min； 第三层胶：移开盖片，滴加100L质量分数为0.5%的LMA于第二层胶上，加盖片， 4凝固10min。 4. 裂解 将制好的凝胶放入冷的裂解液中，4下裂解2小时； 裂解液使用时新配(铺完第二层胶后即可配制) 90ml lysis solution 10ml DMSO 1ml Triton-X1005. 解旋 从裂解液中将载玻片取出，在蒸馏水中洗去过多盐，晾干。 将新配制的电泳缓冲液倒入电泳槽中，约覆过载玻片0.25cm，盖上盖子，在高pH电泳缓冲液中放置20 min以便DNA解螺旋。6. 电泳 室温下调节缓冲液液面高低，于20V，200mA下电泳20min。 7. 中和 将凝胶浸入0.4M Tris缓冲液（pH7.5）中，浸洗 30min。8. 染色观察 用20g/L的吖啶橙染色35min，用双蒸水洗掉表面的染料，24小时内在荧光显微镜下观察。 三 结果观察050100150253035404550Tail DNA%H2O2浓度05010015046810121416182022Tail momentH2O2浓度四 注意事项 实验操作均在红光或暗处条件下进行，以避免造成DNA的额外损伤。 关键步骤是铺胶，尤其是第一层胶，一定要平整，均匀。若有气泡，用下一层胶填平。 配制裂解液时，DMSO为致癌剂，注意安全。用去尖的枪头取Triton-X100五 思考题 试分析三层胶浓度不同的原因。 试分析影响单细胞凝胶电泳实验结果的因素。21 结束语结束语