最新叶绿体色素的提取理化性质与含量测定ppt课件.ppt

叶绿体色素的提取理化性质与叶绿体色素的提取理化性质与含量测定含量测定 提取叶绿体色素提取叶绿体色素 分析叶绿素的物理、化学性质分析叶绿素的物理、化学性质 测定叶绿素的含量测定叶绿素的含量 提取和测定植物组织中的光合色素是研究光提取和测定植物组织中的光合色素是研究光合作用机理的重要技术手段合作用机理的重要技术手段。1. 实验目的及意义实验目的及意义 2 2）取代反应）取代反应卟啉环中的卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。等离子取代。稀酸：稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，叶绿素溶液与稀酸作用，Mg可以被可以被H+所取代而成所取代而成褐色褐色的的去镁叶绿去镁叶绿素素，去镁叶绿素去镁叶绿素遇遇Cu2+则成为则成为深绿色深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏（在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。浓酸：浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被被H+取代，且生成的取代，且生成的去镁叶绿素去镁叶绿素迅速迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。1 1）吸收光谱）吸收光谱 红光区：红光区：640660 nm；篮紫光区：；篮紫光区：430450 nm 。2 2）荧光现象）荧光现象 叶绿素溶液在透射光下呈叶绿素溶液在透射光下呈绿色绿色，而在反射光下呈，而在反射光下呈红色红色。3 3）皂化反应）皂化反应 叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反应而生成醇和叶叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反应而生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。分开。 4）取代反应取代反应 在稀酸中，叶绿素中的镁可以被在稀酸中，叶绿素中的镁可以被H+所取代而成所取代而成褐色褐色的的去去镁叶绿素镁叶绿素，后者遇，后者遇Cu2+则成为则成为绿色绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。在浓酸中，叶绿素中的定，在光下不易破坏。在浓酸中，叶绿素中的Mg被被H+取代，且生取代，且生成的成的去镁叶绿素去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色褐绿色。 5）叶绿素的化学性质很不稳定，叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏容易受强光的破坏，特别是当叶绿，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素的理化性质叶绿素的理化性质 1）叶绿素）叶绿素a、b分别在分别在665nm和和649nm波长处波长处（95%乙醇提取）乙醇提取）有最大的吸有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素收峰，同时在该波长处叶绿素a，b的比吸收系数的比吸收系数K为已知，我们即可以根为已知，我们即可以根据据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：定律，列出以下关系式： Ca=13.95A665 6.88 A649 Cb=24.96 A649 7.32 A665 CT =Ca + Cb= 18.08 A649 + 6.63A665A665和和A649为叶绿素溶液在波长为叶绿素溶液在波长665 nm和和649 nm时的吸光度时的吸光度Ca、Cb、CT分别为叶绿素分别为叶绿素a 、 b及总的浓度，以及总的浓度，以mgL-1为单位为单位 2）叶绿素）叶绿素a 、b在在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为波长处有相同的比吸收系数（均为34.5），在此），在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素a 、b的总浓度。的总浓度。 CT=（A6521000）34.5 3）叶绿素的含量）叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度叶绿素的浓度提取液体积提取液体积稀释倍数稀释倍数/样样品鲜重品鲜重 2.4 2.4 叶绿素含量的计算叶绿素含量的计算 3. 材料、仪器设备与试剂材料、仪器设备与试剂材料：材料：菠菜叶片菠菜叶片仪器：仪器：试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试剂：试剂：石英砂、碳酸镁、石英砂、碳酸镁、95乙醇、乙醇、20%NaOH-甲醇、甲醇、 苯、苯、 36%乙酸、醋酸铜、浓盐酸乙酸、醋酸铜、浓盐酸 叶绿体色素提取叶绿体色素提取 称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中，剪碎放入研钵中， 加少量石英砂和加少量石英砂和碳碳酸镁酸镁及及5ml 95乙醇，研成均浆，过滤入乙醇，研成均浆，过滤入25ml 容量瓶，分别用容量瓶，分别用5ml 95乙醇冲洗研钵乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用95乙醇定容至乙醇定容至25ml，放入暗处备用。，放入暗处备用。2. 叶绿素的荧光现象叶绿素的荧光现象 取叶绿素提取液取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？光的颜色有何不同？ （结果与分析（结果与分析1） 3. 光对叶绿体色素的破坏作用光对叶绿体色素的破坏作用 取两支试管，各加入叶绿体色素提取液取两支试管，各加入叶绿体色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一，一管放在直射光下，另一管放在黑暗处，管放在黑暗处，12 h后观察两管溶液颜色有何变化？后观察两管溶液颜色有何变化？（结果与分析（结果与分析2）4. 实验步骤实验步骤4. 叶绿素的皂化作用叶绿素的皂化作用 3ml提取液提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀）甲醇（摇匀） 冷却冷却 + 3ml苯（摇匀）苯（摇匀） + 3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀）蒸馏水（逐滴加，摇匀） 静置，观察分层现象。静置，观察分层现象。下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和和b（以及少量的叶黄素）；（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 对照：对照：另取另取3ml 叶绿体色素提取液，加入叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和苯和2ml 蒸馏水观察与皂化的蒸馏水观察与皂化的叶绿素有何不同？叶绿素有何不同？（结果与分析（结果与分析3）60水浴水浴 3min5. H+和和Cu2+对叶绿素分子中对叶绿素分子中Mg2+的取代作用的取代作用1）吸取叶绿体色素提取液）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇乙酸数滴，摇匀，观察溶液颜色的变化。匀，观察溶液颜色的变化。 （结果与分析（结果与分析4.1）2）当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒）当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋酸醋酸铜粉，水铜粉，水浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。（结果与分析结果与分析4.2）3）吸取叶绿体色素提取液）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色变化。变化。 （结果与分析（结果与分析4.3）6. 叶绿体色素含量测定叶绿体色素含量测定吸取叶绿体色素提取液吸取叶绿体色素提取液5ml，用，用95%乙醇定容至乙醇定容至50ml。以。以95%乙醇为空白乙醇为空白对照，在波长对照，在波长665nm、649nm、652nm下测定吸光度，并分别计算叶绿素下测定吸光度，并分别计算叶绿素a和叶绿素和叶绿素b的浓度（的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。），二者之和为总叶绿素的浓度。最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度叶绿素的浓度稀释倍数稀释倍数提取液体积提取液体积 /样品鲜重样品鲜重比较两种方法所得的实验结果。比较两种方法所得的实验结果。 （结果与分析（结果与分析5）5. 结果与分析结果与分析详见实验步骤详见实验步骤（结果与分析（结果与分析1-6）6. 注意事项注意事项1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些，以不超过研磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。分钟为宜。2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。3）分光光度计的正确使用。）分光光度计的正确使用。1）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？体色素往往效果不佳，原因何在？2）研磨提取叶绿素时加入）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？，有什么作用？3）叶绿素）叶绿素a、叶绿素、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素收峰波长进行叶绿素a、叶绿素、叶绿素b的定量分析？为什么？的定量分析？为什么？ 7. 思考题思考题加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。具体的情况是这样的：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，具体的情况是这样的：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用酸性，可起到保护叶绿素的作用 。