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    色谱分析复习资料[重点整理背诵版].doc

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    色谱分析复习资料[重点整理背诵版].doc

    色谱分析法定义: 色谱 (chromatography)分析法:以试样组分固定相(stationary phase )和流动相(mobile phase )间的溶解、吸附、分配、离子交换或其它亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱分析法即利用物质的物理及物理化学性质的差异,将多组分混合物进行分离测定的一种分析方法。色谱分析法是仪器分析常用的方法之一。应用对象:主要是混合物中有机成分的分离和分析1.色谱法的由来2.固定相和流动相的变化3.色谱柱、分离机制的变化高效液相色谱仪色谱分析法的分类v 1、按两相的聚集状态 流动相 固定相 类型v 2、按分离的原理分类v 吸附色谱:吸附性能的差异 气固 液固v 分配色谱:分配系数的不同 溶解度 液体v 离子交换色谱:分离组分与固定相离子进行可逆交换 离子交换树脂v 空间排阻色谱:分子筛 葡聚糖凝胶v 3、按固定相的材料和使用方式v 柱色谱(玻璃、不锈钢、石英) 气固 液固v 纸色谱 液液v 薄层色谱(硅胶、聚酰胺) 液固v 4、按色谱动力学过程分类v 冲洗法、顶替法、迎头法v 5、按色谱技术分类色谱分析法的特点和局限性 一、 特点1、选择性好1理论塔板数高2固定相、流动相 3操作温度a沸点相近的混合物b同位素c同分异构体d对映异构体2、分离效率高,分析速度快1气相色谱a气体黏度小b长色谱柱2高效液相色谱a高压泵b多色谱填料3、 灵敏度高、样品用量少 检测器a热导池检测器b氢火焰离子化检测器c电子俘获检测器d火焰光度检测器4、应用范围广 1气相色谱a气体b易挥发的有机物c沸点高d热裂解2高效液相色谱a不易挥发、高沸点b不稳定c糖类、大分子化合物 d药物分析3石油工业、环境保护、临床化学、药物与药剂、农药、食品、卫生防疫理化检验、司法检验二、局限性v 给不出定性结果,需要已知的标物质作对比,或将样品的数据与标准物质的数据进行对比,与质谱、红外等波谱鉴定仪器联用v 定量时需要标准物质v 对个别异构体和固体物质分析能力差色谱图和相关术语v 1、色谱图(chromatogram):进样后检测仪器记录下来的检测器响应信号随时间或载气流出体积分布的曲线图。v 2、基线(baseline):当没有组分进入检测器时,色谱流出曲线是一条只反映仪器噪声随时间变化的曲线。(正常操作条件下,检测器对流动相的响应信号)v 3、色谱峰(chromatographic peak)样品随流动相经过色谱柱后,分离开的各组分经过检测器时产生的吸收峰,峰状微分曲线。v 4、峰面积(area)组分流出的曲线与基线所包围的面积。(CGEAFHD)表示:符号Av 5、峰底(peak base)色谱峰下面的基线延长线(峰起点到终点间的直线CD)v 6、峰高色谱峰最高点至峰底的垂直距离AB' 表示符号:hv 7、峰宽(W):沿色谱峰两侧拐点所作的切线与峰底相交两点之间的距离。IJ。符号:v 8、半峰宽(Wh/2) :半峰宽:峰高为0.5h处的峰宽。GH。v 9、标准偏差():峰高0.607h处峰宽EF的一半。v 区域宽度:色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一,可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄,其效率越高,分离的效果也越好。v 保留时间(rentention time, t) :组分从进样到出现峰最大值所需的时间v 死时间(dead time, t0):不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间,它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用,因此,其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速 vv 调整保留时间(adjusted retention time, tr ):某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间,它是组份在固定相中的滞留时间。即由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关,因此有时需用保留体积来表示保留值。 v 死体积V0:色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到:v Fco为柱出口的载气流速(mL/min)vvv F0-检测器出口流速;Tr-室温;Tc-柱温;p0-大气压;pw-室温时水蒸汽压。v 保留体积Vr:指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积调整保留体积Vr':某组份的保留体积扣除死体积后的体积(以上保留时间和保留体积又统称保留值。)色谱曲线的意义:1色谱峰数=样品中单组份的最少个数;2 色谱保留值定性依据;3 色谱峰高或面积定量依据;4 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标;5 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。平衡理论、1、分配系数(K) 在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值。K与温度有关,与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。固定相不变的情况下,K与温度呈反比。一定温度下,组分的分配系数 K 越大,出峰越慢。v 每个组分在各种固定相上的分配系数K不同;选择适宜的固定相可改善分离效果。v 气相色谱中,柱温是一个很重要的操作参数,对分离度影响大v 液相色谱中,温度对分离度的影响小2、分配比(k) 在一定温度和压力下,组分在两相间分配达到平衡时,在固定相和流动相中的质量比,称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。也叫容量因子或容量比。分配比 k 的求算:k也等于组分的校正保留时间与死时间的比值。k可表示出组分在柱中停留时间的长短。k越大,保留时间也就越长。K 与 k 的关系:b 称为相比率,是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱,b = 635;对毛细管柱, b = 60600。K只决定于组分和两相性质,与体积无关。 k不仅与组分和两相性质有关,与相比有关,即与固定相的量有关。v K与k分别为浓度比和质量比,与组分和固定相的热力学性质相关v K只决定于组分和两相性质,与体积无关。 k不仅与组分和两相性质有关,与相比有关,即与固定相的量有关。v 对于给定色谱,分离度由量决定,k为衡量保留能力的重要参数选择因子a :1.A为先流出的组分,B 为后流出的组分。2.K 或 k 反映的是某一组分在两相间的分配;而选择因子 a 是反映两组分间的分离情况。3.两组分 K 或 k 相差越大时,a 越大,分离得越好。4.两组分在两相间的分配系数不同,是色谱分离的先决条件二、塔板理论v 塔板理论是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论。v 塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔,即将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。v 塔板的概念是从精馏中借用的,成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。塔板理论假定:1)塔板之间不连续;2)塔板之间无分子扩散;3)组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡,达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H;4)某组分在所有塔板上的分配系数相同;5)流动相以不连续方式加入,即以一个一个的塔板体积加入(脉冲式)。(一)塔板理论概念:塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔,塔内存在许多塔板,组分在每个塔板的气相和液相间进行分配,达成一次分配平衡。随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡后,分配系数小的组分,先离开蒸馏塔(色谱柱),分配系数大的组分后离开蒸馏塔(色谱柱),从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。(二) 柱效能指标:对于一个色谱柱来说,其分离能力(柱效能)的大小主要与塔板的数目有关,塔板数越多,柱效能越高。 v 1理论塔板数tR为某组分的保留时间; W1/2为某组分色谱峰的半宽度;W为色谱峰的峰宽。柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关。保留时间越大,峰越窄,理论塔板数就越多。柱效能也就越高。v 理论塔板高度,即组分在柱内每达成一次分配平衡所需要的柱长叫理论塔板高度。H越小,表示柱效能越高。v 2.有效塔板数(neff) 在以上计算理论塔板数的式子中使用的是保留时间,它包括了死时间,它与组分在柱内的分配无关,因此不能真正反映色谱柱的柱效。vv Heff=L/neff3.塔板理论的特点:v (1)当色谱柱长度一定时,塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小),被测组分在柱内被分配的次数越多,柱效能则越高,所得色谱峰越窄。v (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同,用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质。v (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果,当两组分的分配系数 K 相同时,无论该色谱柱的塔板数多大,都无法分离。v (4)塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。三、速率理论:塔板理论是一个半经验性的理论。它定性的给出了板高的概念,但不能指出影响板高的因素。速率理论就是在塔板理论的基础上,给出了影响塔板高度的因素:u 为流动相线速度; A,B,C为常数,其中 A分别表示涡流扩散系数;B分子扩散系数;C传质阻力系数(包括液相和固相传质阻力系数)。该式从动力学角度很好地解释了影响板高(柱效)的各种因素。任何减少方程右边三项数值的方法,都可降低H,从而提高柱效。四、分离度及色谱分离方程1.分离度(Resolution, R):同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。R 越大,相邻组分分离越好。当R=1.5 时,分离程度可达99.7%,因此R=1.5 通常用作是否分开的判据。2.色谱分离方程1)分离度R 与柱效的关系2)分离度R与保留因子a 的关系3)分离度R 分配比 k 的关系例:两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min,有一不与固定相作用的物质,其在此柱上的保留时间为1.30 min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问:1)柱分辨率R;2)柱平均理论塔板数nav3)平均塔板高度Hav4)若要求R达到1.5,则柱长至少应为多少?5)使用上述较长的柱进行分析时,其分析时间为多长?6)不增加柱长,要求在原来的分析时间内R达到1.5,该柱的塔板高度应为多少?气相色谱法气相色谱常用术语和参数1.色谱图:进样后检测仪器记录下来的检测器响应信号随时间或载气流出体积分布曲线图。2.前伸峰(leading peak):前沿平缓后部陡起的不对称色谱峰3.脱尾峰(tailing peak):前沿陡起后部平缓的不对称色谱峰4.畸峰(distorted peak):形状不对称的色谱峰。5.反峰(negative peak):峰形与通常相反的色谱峰,也称倒峰、负峰。6.假峰(ghost peak):除组分正常产生的色谱峰外,由于其它原因产生的吸收峰7.净保留体积(net retention volume):用压力梯度校正因子修正后的组分调整保留体积,VN8.比保留体积(specific retention volume):组分在每g固定液校正到273.15K时的净保留体积,Vg9.相比率(phase ratio):气相与吸附剂或固定液体积之比=VG/VS,VG/VL10.分配系数(partition ration)11.容量因子(capacity factor)12.相对保留值relative retention value:相同操作条件下,组分与参比 物质的调整保留值之比ri,s13.柱外效应extra-column effect:进样室到监测器之间的部分气路部分,由于进样方式、柱后扩散等因素对柱效能产生的影响。14.反吹backflushing: 一些组分被洗脱后,将载气反向通过色谱柱,使其他组分向相反方向移动的操作 作用:节省时间,防止污染下一根色谱柱。15.老化 conditioning:色谱柱在高于使用柱温下通载气进行处理的过程16.柱流失column bleeding: 固定液随载气流出柱外的现象毛细管柱气相色谱法Capillary column gas chromatography :是利用毛细管柱作为气相色谱柱的一种高效、快速、高灵敏的分离分析方法。进样系统:1.分流进样:进样时有吹扫气,气化样品大部分经分流管放空,只小部分被载气带入色谱柱;2.不分流进样:进样时不进行吹扫,大部分样品进入色谱柱后才打开分流阀,进行吹扫;3.直接进样:气化室没分流系统,色谱柱与大口径毛细管柱直接相连4.冷柱头进样硅藻土的预处理: 由于硅藻土在处理过程中产生的酸、碱性;表面的硅醇基;微孔结构等因素致使样品信号拖尾或造成死吸附(1)酸洗。除去载体表面铁等金属化合物。 浓盐酸浸泡载体,加热煮30min,然后用水洗至中性,再用甲醇淋洗,烘干,过筛(2)碱洗。除去Al2O3等碱性杂质。酸洗载体在10%NaOH-甲醇溶液中浸泡或回流,然后用水洗至中型,再用甲醇淋洗,烘干,过筛(3)硅烷化。消除表面的硅醇基,减弱生成氢键的能力,使表面惰化。盐酸浸泡载体,用硅烷试剂与之反应生成Si-O-Si-C键。该类载体适合分析水、醇、胺等易形成氢键而拖尾的物质;只能涂渍非极性或极性弱的固定液,只能在270以下使用,柱效也差。 (4)釉化。堵塞载体表面的微孔和改变表面性质。置于2%硼砂水溶液中浸泡, 抽滤后,用和其体积相当的0.5%的硼砂水溶液淋洗,干燥后于870 灼烧3.5h,再升温到980 灼烧40min,冷却,用蒸馏水煮4次,洗涤并干燥。 该类载体吸附性能低,机械强度增加,适于分析醇、酸类极性较强的物质。分析甲醇、甲酸时有不可逆吸附。(5)脱活剂。 用一些表面活性剂饱和载体表面的吸附中心。 非离子型的聚乙二醇类;阳离子型的胺类-碱性样品;阴离子型的二羧酸、酸酐-酸性样品。选用载体的几个原则:A非极性组分-红色硅藻土载体;极性组分-白色硅藻土载体b要求进样量大和负荷固定液多-红色硅藻土载体c分析腐蚀性气体时用氟载体d分析非极性高沸点组分,可选玻璃微球载体固定液应具备的条件:1.对组分良好的选择性:对欲分离的两组分有较大的相对保留值2.蒸气压低:从色谱柱流失的固定液少,柱子的效能不变,不妨碍适用高灵敏度监测器3.润湿性好:能很均匀的涂布在载体表面或空心柱的内壁4.热稳定性好:在高温下发生分解或聚合反应5.化学惰性好:不与组分、载体、载气发生不可逆的化学反应6.凝固点低,黏度适当:a凝固点低低温使用b黏度适当减少因柱温下将黏度变大而造成的柱效降低的弊端7.成分稳定:防止各批次间固定液成分差别大,影响色谱峰定性的重复性顶空气相色谱法:定义:用气相色谱法分析封闭系统中与液体或固体达成热力学平衡的气相,从而间接测定液相或固相阳品中的组分A色谱分析-气相辅助技术B气相色谱分析-检测器高效液相色谱法与气相色谱法相比:气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物,而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质,如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以,HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。 1.不受试样的挥发性和热稳定性的限制,应用范围广;2。可选用各种溶剂作为流动相,对分离的选择性有很大作用,选择性高;3。一般在室温条件下进行分离,不需要高柱温。 特点(四高一广)高压:液体流动相受到的阻力大,施加高压以便迅速通过分离柱高效:GC 柱效约2000块/m, HPLC 柱效约30000块/m以上, 高灵敏度:采用高灵敏度检测器以提高分析灵敏度,UV 10-9g, 荧光检测器 10-11g。高速:分析时间短应用范围广:能适应于高沸点和热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。二、影响分离的因素:1、流 速,流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速,柱效提高不是很大。2、涡流扩散项及其影响 :降低固定相粒度粒径小的、分布均匀的球形固定相可提高柱效。3、传质阻力项及其影响 超临界流体色谱法超临界流体色谱(supercrical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体作为流动相的色谱方法,是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支,所谓超临界流体,是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体,也不是液体,但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性·与GC法和HPLC法比较,因超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相,对溶质的传质阻力小,可以使用更高的流速洗脱,因此SFC的分离速度快于HPLC而与GC相当;超临界流体的扩散率介于GC和LC之间,因而峰展宽小于在气体中。·SFC中的流动相不是惰性的传输介质,这不同于GC而与LC一样,溶质与流动相间有相互作用,利用此点可调控选择因子·在一定压力下,超临界流体溶解的分子的分压比在气体中高几个数量级,这就可以实现对大分子、热不稳定性化合物、 高聚物等的有效分离。平面色谱法二、平面色谱法的基本流程:确定样品的预处理方法选择吸附剂和展开剂制备层析用薄板点样层析分离显色定性或定量分析分析结果,给出结论三、平面色谱法参数(一)定性参数1. 比移值Rf (retardation factor; Rf) 溶质移动的距离与流动相移动距离之比Rf范围: 0< Rf <1 Rf = 0.20.8(常用) Rf = 0.30.5(最佳2. 相对比移值Ris 参考物与被测组分在完全相同条件下展开,可以消除系统误差,大大提高重现性和可靠性;参考物可以是后加入纯物质,也可是样品中已知组分相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关,范围可以大于或小于1(二)面效参数1、理论塔板数 N=16(ds/W)2 ds:原点到斑点中心的距离 W:组分斑点的纵向宽度2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds:原点到展开剂前沿的距离 N越大,H越小。 (三)容量因子k与比移值Rf的关系容量因子: k=ts/tm ts 、 tm 分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间保留值的定义: 四)分离参数1、分离度(resolution; R) 两相邻斑点中心的距离与两斑点平均宽度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2) =2d/(W1+W2)ds1 、ds2 :分别为原点至两半斑点中心的距离, W1、W2斑点的宽度。2.分离数(separation number; SN) 相邻斑点分离度为1.177时,在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂前沿)之间能容纳的色谱斑点数。W(1/2)0, W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点处和溶剂前沿处的半峰宽。一般薄层板的分离数为 710,高效薄层板可达1020。SN是衡量分离容量的重要参数。1TLC定义:将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上,形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程:铺板 活化 点样 展开 定位(定性)/洗脱(定量)3分离机制:吸附* 、分配*、离子交换、空间排阻4特点;分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色 方便。5应用:药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。(一)吸附薄层色谱 固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分离.K大,Rf值小,移动慢;K小,Rf大,移动快。(二)分配薄层色谱 固定相为液体,吸附或化学键合在载体上。利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色谱法,固定相是烷基化学键合相,展开剂是水及与水相溶的有机溶剂。 吸附剂的选择:根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强弱极性吸附剂 被测物极性弱强极性吸附剂定性分析 利用保留值A测定Rf值b测定相对Rf值,即Ris值。c利用二维色谱(改变色谱条件,比较Rf值是否一致) 定量分析 1. 目视比较半定量2. 测量斑点面积3. 洗脱法4. 薄层扫描法毛细管电泳(capillary electrophresis, CE),又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophresis, HPCE)以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,以样品的多种特性(电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为根据的液相微分离分析技术。基本概念电泳 (electrophoresis) 是指在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向所带电荷相反的方向发生迁移的电动现象。电渗 (eletroosmosis) 是指在电场作用下,毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。淌度(em)单位电场(E)下的电泳速度()称为为淌度。 em= /E em = em (L /V) = ( l / tm )(L /V) 电渗 与固液界面的双电层有着密切的关系 CE所用的石英毛细管,pH值大于3时,内表面带负电,和溶液接触形成一双电层 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子,相对于毛细管壁的负电荷表面,形成一个圆筒形的阳离子鞘EOF:在电场作用下,溶剂化了的阳离子,沿滑动面与紧密层作相对运动,携带着溶剂一起向阴极迁移,便形成了电渗流(electroosmotic flow ,EOF)。电渗流的意义1. 电泳过程中,伴随着电渗现象2. 电渗流的速度比电泳速度快57倍3. 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向,产生差速迁移,在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析4. 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数,控制电渗流的大小和方向,可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。 浓度型检测器:测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化,即检测器的响应值和组分浓度成正比质量型检测器:测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化,即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的质量成正比

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