2022年腺病毒载体的构建 .pdf

第四章SOCS2 腺病毒载体的构建1 腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2 在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH可以诱导 SOCS2稳定高表达。SOCS2高表达的同时， GH 诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。为了研究SOCS2对 GH 调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低， 如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞 (Vorburger SA and Hunt KK 2002)。 另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单 (Luo JY et al. 2007)。本章克隆 SOCS2基因，采用 pAdEasy 系统构建 pAd-SOCS2载体，为 SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对 GH 调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。4.1 材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取自 6 周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5 菌株由本实验室保存； pAdTrack-CMV 和 pAdEasy-1 质粒， E.coli BJ5183 菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293 购于中国科学研究院上海细胞资源中心。4.1.2 主要试剂限制性内切酶Bgl、Xho和蛋白 Marker 购自 Fermentas公司；内切酶 PmeI 和PacI购自 NEB 公司； pMDTM18-T 克隆载体、碱性磷酸酶CIPA 购自 Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux 公司； /Hin dIII Marker 购自天根公司； OptiMem 优化培养液购自Gibico 公司；脂质体 LipofectamineTM2000购自 Invitrogen 公司。载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同 3.1。4.2 试验方法4.2.1 SOCS2基因克隆4.2.1.1组织中总 RNA 提取名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 15 页 - - - - - - - - - 根据 Takara RNAiso Plus试剂说明提取组织中总RNA：4.2.1.2 cDNA 第一链合成同 3.2.6 提取的总 RNA 反转录为总 cDNA，表 3-1 为反应体系和操作流程：表 3-1 cDNA 第一链合成体系及操作过程Table 3-1 RevertAidTM First Strand cDNA Sythesis system and operation protocol 反转录合成cDNA 第一链总 RNA 1.5 LPrimer：Oligo （dT）18 primer 1 LDEPC 处理水9.5 L轻微震荡混匀，65孵育 5min，冰上冷却2min；瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：5 反应缓冲液4 LRiboLockTM 核糖核酸酶抑制剂（20 u/ L ）1 L10 Mm dNTPs 混合物2 LRevertAidTM M-MuLV反转录酶（ 200 u/L）1 L瞬时离心收集反应液，25孵育 5min，42孵育 60min；70 5min 终止反应，反应产物直接用于 PCR 或 -20存放备用。4.2.1.3 SOCS2基因编码区（ CDS）的扩增依照扩增CDS 全长的引物设计原则，根据Genbank 公布的SOCS2 基因序列(NM_007706.3)，用Primer Premier5.0 软件设计 SOCS2扩增引物，表4-1 中SOCS2-F 和SOCS2-R为 SOCS2基因的扩增引物。表 4-1 SOCS2 CDS 区扩增引物Table 4-1 Primers of SOCS2 CDS sequence Primer names Primer sequence (5 -3 ) SOCS2-F：SOCS2-R CATAGCTGCATTCGGAGA SOCS2-F-Bgl GCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG SOCS2-R-Flag-Xho GCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT TGTAATCTACCTGGAATTTATATTCTT 4.2.1.4 SOCS2 CDS区的扩增体系和条件用表 4-1 中的 SOCS2 -F 和 SOCS2 -R 引物，按照表4-2 中的扩增体系和条件扩增SOCS2 CDS 区。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 15 页 - - - - - - - - - 第四章SOCS2 腺病毒载体的构建3 表 4-2 SOCS2 CDS 区的扩增体系和条件Table4-2 PCR amplification system and 10 PCR 缓冲液1.25 LdNTP Mixture （各2.5 mM ）2 L上、下游引物（10M ）各 0.5 LcDNA 1.3 LddH2O 7.45 L瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：预变性（ 95）5min 反应一：（20 个循环）变性（ 95）40s 退货（ 62，每个循环降0.5，共 20 循环）40s 延伸（ 72）50s 反应二：（20 个循环）变性（ 95）40s 退火（ 57）40s 延伸（ 72）50s 反应三：延伸（ 72）8min 反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4， -20可存放一周4.2.1.6 SOCS2 CDS区的 T 载体克隆及鉴定依照 Takara pMDTM18-T 克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2 CDS 全长克隆至pMDTM18-T；A. 克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；pMD18-T（50 ng/ L）1 L 插入的目的片段（ 0.1-0.3 pmol）3.5 LdH2O 0.5 LSolution5 LB. 瞬时离心，收集反应液。16孵育过夜 (12 h)； 将连接产物 10 L 加入到 100 L DH5感态中，冰浴 30 min；C. 42热击 45s，迅速冰浴 1 min，此过程不可激烈晃动PCR 管，否则影响转化效率；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 15 页 - - - - - - - - - D. 加入 1 mL LB 无抗性培养液， 37、200 rpm 震荡培养 1 h；E. 室温、4000 rpm离心 5 min，收集菌体；吸弃 900 L 培养液上清， 用枪头吹打 100 L余液，重悬菌体；F. 无菌条件下，将 100 L 菌液均匀的涂于含Amp 的 LB 固体平板， 37倒置培养；E. 培养约 12 h，无菌条件下，挑取单菌落于含 Amp 的 LB 液体培养液中， 37、250 rpm震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR 检测；阳性克隆送至金斯瑞公司测序。4.2.2 DH5 感受态的制备 (CaCl2) 无菌条件下，将冻存的DH5 划线接种于无抗性的LB 固体平板上， 37 倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100 mL 无抗性的 LB 液体培养液中，于37、250 rpm，震荡培养过夜 (约 16 h)；A.从中吸取 1 mL 菌液接种于 100 mL 无抗性的新鲜培养液， 37、 250300 rpm 培养 23 h，从 2 h 开始不断对菌液测OD=600值，直至 0.4OD=6000.6(0.45 为最适 OD 值)；B.以下步骤必须均需无菌冰上操作， 0.1M CaCl2和含 1520%甘油的 0.1M CaCl2需要预冷处理；C.取 30 mL 菌液于 50 mL 离心管，冰上冷却10 min；D.4 4500 rpm 离心 5 min 收集菌体；加 3 mL 0.1M CaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置 20 min；E. 4 4500 rpm离心 5 min，收集菌体；加 3 mL 含 1520%甘油的 0.1M CaCl2，枪头吹打混匀菌体；每 100 L 分装一管， -80 冻存。4.2.3 质粒转化A. -80冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；B. 向 100 L 感受态中加入连接产物 (含量 50 ng ， 体积10 L)， 摇匀，冰上静止 30 min；C. 42 水浴热激 90 s，或 37水浴 5 min，热击后迅速置于冰上，静止5 min；操作过程不要有激烈摇动；C. 向离心管中加 1 mL 无抗性 LB 培养基，混匀后，37 250 rpm振荡培养 1 h，细菌恢复正常生长，抗性基因开始表达；D. 将上述菌液 4000 rpm离心 5 min，弃去 1 mL 上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应抗性的 LB 固体平板，放置 30 min 后，37倒置培养过夜。4.2.4 质粒的小量提取挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB 培养基中， 37 300 rpm 激烈振荡培养 1216 h，获得的新鲜菌液依照Omega E.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 15 页 - - - - - - - - - 第四章SOCS2 腺病毒载体的构建5 4.2.5 重组穿梭穿梭质粒的构建4.2.5.1 SOCS2 CDS 区的 PCR 扩增和回收以pMDTM18- SOCS2 穿 梭 质 粒 为 模 板 ， 表4-1中SOCS2 -F-Bgl 和SOCS2 -R-Flag-Xho分别为上游和下游引物，按表4-2 中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2 ，所用引物带有所需要的酶切位点(下划线部分 )和 Flag 标签(斜体部分 )。PCR产物用 1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5 步骤回收 PCR 产物，微量定量仪测定浓度待用。4.2.5.2 SOCS2基因和 pAdTrack-CMV 穿梭质粒的的双酶切及回收以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA 进行 Bgl和 Xho的双酶切，穿梭质粒酶切体系：10 Buffer 2 LpAdTrack-CMV(0.5 1 g/ L) 6 LBgl0.6 LXho0.6 LdH2O 10.8 LSOCS2 PCR产物酶切体系：10 Buffer 2 LSOCS211 LBgl1 LXho1 LdH2O 15 L 瞬时离心收集反应液， 37孵育 5 h，产物进行 1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按 4.2.5 步骤回收双酶切的 DNA ，测定浓度备用。4.2.5.3 SOCS2基因与 pAdTrack-CMV 穿梭质粒片段的连接将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA 和穿梭穿梭质粒DNA 以 10:1 的摩尔比混合， T4 连接酶连接，连接体系如下：瞬时离心收集反应液， 16孵育过夜，取 10 L 连接产物按 4.2.3步骤将重组穿梭穿10 Buffer 2.5 LSOCS2 CDS(约 0.3 pmol) 5.5 LCMV( 约 0.03 pmol) 0.7 LT4 连接酶 (350U/L)1 LdH2O 15.3 L名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 15 页 - - - - - - - - - 梭质粒转化 DH5 感受态，于含 Kan(100 g/mL) 的固体 LB 平板， 37倒置培养过夜。挑取生长良好的单克隆，于含15 mL Kan(100 g/mL) 的 LB 液体培养基， 37摇菌过夜，培养液浑浊后，取800 L 菌液甘油 (1520%)冻存备用，其余用于穿梭质粒提取和后期检测。4.2.5.4重组穿梭质粒的菌落PCR 鉴定取 10 L单克隆摇菌获得的菌液， 用无菌水稀释至 100 L ，以 0.5 L 稀释后的菌液为模板，用 SOCS2 CDS 区的扩增引物为检测引物， 按照 SOCS2 CDS 的扩增参数和体系见表 1，进行 PCR 扩增。产物用 1%琼脂糖凝胶检测，凝胶成像观察，依照扩增片段的大小，对挑取的单克隆做初级筛选，以备后续参考。4.2.5.5 重组穿梭质粒的小量提取选取初级筛选正确的单克隆菌液，取5 mL 依照 4.2.4 步骤小量提取穿梭质粒。4.2.5.6 重组穿梭质粒的鉴定和测序A. PCR 鉴定: 用无菌水 10 倍稀释提取的重组穿梭质粒， 取 0.5 L 作为模板，用 SOCS2CDS 区的扩增引物为检测引物，按照表4-1 SOCS2 CDS 全长扩增的反应体系及参数进行 PCR 检测。取 5 L PCR 产物进行琼脂糖凝胶检测，依照扩增片段的大小鉴定SOCS2是否与重组质粒连接。鉴定正确的质粒用将酶切鉴定。B. 酶切鉴定：重组质粒PCR 鉴定正确的质粒，进行Bgl和 Xho双酶切鉴定，体系：重组质粒 (0.51 g/ L) 5 LBgl0.6 LXho I 0.6 L10 Buffer 2 LH2O 11.8 L瞬时离心收集， 37酶切 5 h，酶切产物取 5 L ，与 2 L 上样缓冲液混匀，于1%琼脂糖进行电泳检测， 依照 Mark 大小判断是否酶切出大片段pAdTrack-CMV ，和小片段 SOCS2 。C. 选择 PCR 与酶切鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，测序结果与GenBank所公布的序列一致的，命为pAdTrack-CMV- SOCS2 。4.2.6 pAd-SOCS2的构建4.2.6.1 E.coli BJ5183及含 pAdEasy-1 质粒的 E.coli BJ5183感受态的制备A. E.coli BJ5183 感受态制备：将 -80冻存的 E.coli BJ5183 菌株，划线于含链霉素 (3050 g/mL) 的 LB 平板， 37倒置培养 1216 h，如果菌液冻存时间过长，有必要进行二次活化，即挑取单克隆二次划线，最终获得的单克隆摇菌培养，CaCl2法制备感受态，具体步骤见4.2.2. B. 含 pAdEasy-1 质粒的 BJ5183 感受态制备：依照4.2.3 步骤将 pAdEasy-1 质粒转化于名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 15 页 - - - - - - - - - 第四章SOCS2 腺病毒载体的构建7 BJ5183感受态， 涂于含 Amp(100 g/mL) 的 LB 平板， 挑取单克隆于含 Amp(100 g/mL)的液体 LB 培养基，待菌液浑浊后， 同样用 CaCl2法获得含 pAdEasy-1 质粒的 BJ5183感受态，步骤见 4.2.2。4.2.6.2 Pme酶切线性化 pAdTrack-CMV-SOCS2 和 CIAP 去磷酸化小量提取质粒法获得质粒pAdTrack-CMV- SOCS2 ， 用 Pme酶切线性化，体系如下：SOCS2重组质粒（ 4g）25 L100 BSA 1 L10 Buffer 10 L内切酶2 L双蒸水62 L离心收集， 37温浴 8 h，CIAP 处理 Pme单酶切的质粒，使其去磷酸化防止自我环化，体系如下：线性化质粒60 L(1 20 pmol) 10 Buffer 10 LCIAP 4 LH2O 26 LA. 酶切反应： 37或 50水浴 30 min，B. 抽提 1：加 100 L有机溶液混合物 (苯酚：氯仿：异戊醇比例为25:24:1)，用手激烈摇动，使溶液成为乳浊液，12,000 rmp离心 6 min，取上清液；重复此步骤一次；C. 抽提 2：加等体积 (约 100 L) 的有机混合物 (氯仿：异戊醇比例为24:1)，摇动成乳浊液，离心后取上清；D. 乙醇沉淀：加 10 L 即上清 1/10 体积的 NaOAC(3M) ， 250 L 即上清 2.5倍体积的 -20预冷乙醇， -20冷浴 1 h；E. 收集和洗涤沉淀：12000 rpm离心 12 min； 加 200 L 冷乙醇 (70%)洗涤沉淀，12000 rpm离心 6 min；F. 干燥、溶解核酸：将离心管倒置于滤纸，待管内酒精挥发后，用30 L无菌双蒸水溶解沉淀，冻存备用。4.2.6.3 线性化的重组质粒与骨架质粒重组取一管 -80 冻存的 BJ5183感受态，室温溶化后迅速置于冰上，加10 L 线性化的质粒到感受态细胞中，冰上静止30 min，热击法将线性化质粒转化如BJ5183与骨架质粒pAdEasy-1进行重组，详细步骤见4.2.3。转化产物涂于含Kan(100 g/mL)的 LB 平板，37培养约 20 h。4.2.6.4 重组质粒的筛选和初级鉴定名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 15 页 - - - - - - - - - 重组质粒筛选： 生长 20 h的平板上可以观察到大小不一的菌落，挑取较小的菌落接种于 15mL 含 Kan(100 g/mL) 的液体培养基， 37振荡培养，菌液浑浊后，取800 L 菌液加 200 L 80%甘油-80冻存，其余菌液用作后续鉴定。重组质粒的初级鉴定即菌液PCR，步骤同 4.2.6.4。4.2.6.5 重组质粒的小量提取取 5 mL 初级筛选正确的菌液，依照小量提取质粒的方法提取质粒，具体步骤见4.2.4。获得的质粒微量定量仪测定浓度，以备后续使用。4.2.6.6重组质粒的鉴定和测序A. 质粒 PCR 鉴定：同 4.2.5.6A。B. PacI酶切鉴定： Pac I酶切小量提取的重组质粒，酶切反应体系如下：10 Buffer1 L重组质粒 DNA( 1 g)6.5 L100 BSA 0.2 LPac I酶0.5 LH2O 11.8 L离心收集反应液， 37酶切 5 h 后，65孵育 20 min，使酶失活；取 4 L 酶切产物，加 2 L 上样缓冲液， 0.8%含 EB 琼脂糖凝胶进行检测， 100 V 电泳 1 h 后凝胶成像观察，以空穿梭质粒以骨架质粒的重组质粒为对照。C. 测序：上述鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，与GenBank比对后，把测序正确的质粒命名为pAd-SOCS2 。4.2.7 大量 pAd-SOCS2的获得和 Pac 酶切线性化BJ5183中的质粒提取率较低，所以将pAd-SOCS2转化 DH5 ，步骤详见 4.2.3。从Kan(100 g/mL) 平板上挑取单克隆，于含Kan(100 g/ mL)的 100 mL LB 液体培养基中37 250 rpm摇菌。待培养基浑浊后， 取 800 L 菌液加 200 L 80%甘油冻存，其余菌液全部依照步骤 4.2.4 提取质粒 pAd-SOCS2 ，再用 Pac酶大量酶切重组质粒，体系如下：10 Buffer15 LpAd-SOCS275 L100 BSA 1.5 LPac I(10,000U/mL) 3 LdH2O 55.5 L37孵育 8h，以下步骤同 4.2.6.2B-F。4.2.8 pAd-SOCS2的包装、扩繁和滴度测定名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 15 页 - - - - - - - - - 第四章SOCS2 腺病毒载体的构建9 4.2.8.1 细胞株 HEK293 的复苏与培养A. 取液氮冻存的 HEK 293，迅速于 37中水浴解冻，期间不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀；B. 解冻细胞迅速加到7 mL 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液中， 7 mL 需要提前预热至 37，枪头轻轻吹打，无细胞团存在，1300 rpm 离心 6 min，弃去上清；C. 向离心管中加 2 mL 提前预热到 37的含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液，吹打细胞使其悬浮，按照 5 104将细胞接种于培养皿，于恒温37 的 5 % CO2培养箱培养；D. 24 h 换液；以后每隔2 d 换液一次；细胞密度达90%时传代。4.2.8.2 pAd-SOCS2包装转染前一天，按照每孔 4 105个 HEK 293 细胞接种到 6 孔板，培养 24 h后细胞约有 70%融合，转染前 4 h，用无双抗 PBS清洗 2 次细胞，将含血清的培养液换为无双抗无血清的优化培养液 Opti-MEMI(2 mL/孔)；LipofectamineTM2000 作为转染试剂将 pAd-SOCS2转染至 HEK293 细胞，具体步骤依照说明书进行(所有试剂均为一个孔的试剂用量)：A. 用 Opti-MEMI 优化培养液将 4 g质粒稀释至 250 L，室温孵育；B. 同样用 Opti-MEMI 优化培养液将 10 L LipofectamineTM2000 稀释至 250 L ，室温孵育 5 min；前两步操作不得超过25 min；C. 将孵育的质粒和LipofectamineTM2000 混匀，总体积为 500 L ，整个过程尽量轻柔，混合溶液室温孵育20 min；D. 将 500 L 混合液加到培养板的一个孔中，轻轻晃动培养板混匀培养液；E. 37 5 % CO2培养箱培养， 6 h 后将培养液换为含10%胎牛血清的 DMEM 培养液；其中 6 孔板的 4 个空按上述步骤进行包装，另外两个孔一个为脂质体对照，一个为空白对照。F. 转染 24 h 后可在荧光显微镜下观察， 记录细胞内的绿色荧光蛋白GFP 的表达，观察细胞病变 (Cytopathic effect, CPE)情况。转染 810 d 后形成一般会有蚀斑出现， 此时可将细胞刮下，将细胞收集在冻存管中， 于-196(液氮中 )和 37 反复冻融 5次， 12000 rpm 离心 5 min， 收集的上清液即为病毒原液， 直接用于后续细胞感染或于-80 保存，将病毒液命名为 Ad-SOCS2 。4.2.8.3 Ad-SOCS2的扩繁60mm培养皿培养细胞，待细胞融合至 90%时， 将培养皿中的培养液换为新鲜的10% FBS DMEM 培养液，将 300 L 病毒原液加到培养皿中，轻轻晃动培养皿，加培养24 h后观察细胞形态和荧光蛋白表达，待细胞病变后收取细胞，1500 rpm 离心 6 min 收集细胞，加病毒保存液，于 -196和 37 反复冻融五次，离心去除细胞碎片，根据所需病毒量，继续扩繁病毒或进行病毒滴度测定。4.2.8.4 Ad-SOCS2 滴度测定名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 15 页 - - - - - - - - - 按每孔 2 104个细胞的密度接种HEK293 于 96 孔板中，采用 TCID50法和 Karbers法测定并计算Ad-SOCS2的病毒滴度。将以倍比 (10-110-10)稀释的病毒液感染细胞，每孔加 100 L病毒稀释液，培养910d 统计细胞的 CEP 病变。依照 Karbers 公式即：T=10 101+d (s 0.5) TCID50 /mL 计算病毒得滴度； 其中 s 是阳性比率之和， 也就是所用个稀释度之和。d = log10 稀释度 = 1 (这是对于 10倍的稀释度而言 )； 并且根据公式：T = 1 10X TCID50 /mL = 1 10X 0.7 PFU/mL，可将病毒滴度换为PFU/mL 单位。4.2.9 数据统计及分析试验所得数据用 SPSS 13.0统计软件中的 One-way ANOVA 进行方差分析和显著性检验，数据采用平均值标准差即 Means SD 的形式表示。4.3 结果与分析4.3.1 SOCS2的克隆提取小鼠皮下脂肪组织的总RNA，反转录获得总cDNA。用表 4-1 中的 SOCS2 -F和 SOCS2 -R 引物进行 PCR 扩增，获得大小约为700 bp的片段 (如图 4-1A)。凝胶回收试纯化纯化扩增片段 (如图 4-1B)， T-A 克隆至 p-MD18 载体， 获得重组质粒 p-MD18-SOCS2 ，将重组质粒送金斯特生物公司测序，测序结果与GenBank中的 NM_007706.3 序列进行比对，同源性为 100%。图 4-1 SOCS2基因PCR 及胶回收产物的凝胶电泳分析A.SOCS2 基因的 PCR 产物； B. SOCS2基因的胶回收产物。Fig.4-1 SOCS2 genes electrophoresis analysis of PCR product and gel recovery product . A. PCR product of SOCS2 genes; B. Gel recovery product of SOCS2 genes. 4.3.2 pAd-CMV-SOCS2重组质粒的构建4.3.2.1 SOCS2 基因的扩增及双酶切质粒小提法提取p-MD18-SOCS2重组质粒 (图 4-2)，并于 p-MD18-SOCS2为模板，用表 4-1 中带有酶切位点的SOCS2 -F-Bgl和 SOCS2 -R-Xho引物扩增，琼脂糖凝胶检测可见一条大小约为650 bp 的片段 (图 4-3A)，回收扩增产物并用Bgl和 Xho进行双酶切，将双酶切产物纯化，琼脂糖凝胶检测同样可见大小约650 bp的条带 (图 4-3B)。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 15 页 - - - - - - - - - 第四章SOCS2 腺病毒载体的构建11 图 4-2 p-MD18- SOCS2重组质粒及SOCS2 PCR 产物的凝胶分析及双酶切（ Bgl和 Xho ）回收产物的鉴定A. SOCS2 基因的 PCR 产物； B. SOCS2 基因的 Bgl和 Xho双酶切产物。Fig.4-3 The plasmid of p-MD18-SOCS2 and SOCS2 genes electrophoresis analysis of PCR product and gel recovery product by restrictive digestion of Bgland XhoA. PCR product with Bgl and Xhorestriction digestion site; B Gel recovery product of SOCS2 by double digestion of Bgl and Xho4.3.2.2 pAdTrack-CMV 质粒的提取和双酶切回收图 4-3 pAdTrack-CMV质粒及其双酶切（Bgl 和 Xho）回收产物的凝胶分析A.pAdTrack-CMV质粒； B. Bgl 和 Xho双酶切 pAdTrack-CMV质粒产物Fig.4-3 Electrophoresis analysis of plasmid pAdTrack-CMV and gel recovery product by restrictive digestion of Bgl and XhoA. Plasmid pAdTrack-CMV; B. Gel recovery product of Plasmid pAdTrack-CMV by double digestion of Bgland Xho质粒小提法提取 pAdTrack-CMV 质粒， 用 Bgl和 Xho双酶切质粒 pAdTrack-CMV ，1%琼脂糖电泳检测胶回收的酶切产物，可见一条大小约9200 bp的片段 (图 4-4)。4.3.2.3 pAdTrack-CMV- SOCS2重组质粒的筛选和鉴定T4 连接酶连接 pAdTrack-CMV 和 SOCS2基因的双酶切产物， CaCl2法将连接产物转化入 DH5 感受态细胞，LB 平板 37倒置培养 12 h， 观察并挑取生长良好的单克隆(如图 4-5)。图 4-4 pAdTrack-CMV- SOCS2重组质粒的筛选图 4-4 Selection of recombinant plasmid pAdTrack-CMV-SOCS2 9416 65541 2 3 4 M M 1 2 A. B. 23130名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 15 页 - - - - - - - - - 质粒小提法提取pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒， PCR 鉴定得到的条带大小约为650 bp，与图 4-3A 一致(图 4-6A)。重组质粒进行Bgl和 Xho双酶切鉴定，凝胶电泳检测可见一条约9kb 的大片段，为酶切开的pAdTrack-CMV 质粒，和一条约 650 bp 的小片段即 SOCS2基因片段 (图 4-6B)，结果与预期一致。选取35 个酶切鉴定正确的质粒送金斯瑞生物公司测序，测序结果与GenBank中的 NM_007706.3 序列进行比对，同源性为 100%。图 4-6 pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒的鉴定A. pAdTrack-CMV-SOCS2的 PCR 鉴定； B. pAdTrack-CMV-SOCS2 的双酶切鉴定（Bgl和 Xho）Fig.4-3 Identification of recombinant plasmid pAdTrack-CMV-SOCS2 A. PCR product analysis of pAdTrack-CMV-SOCS2; B. Gel analysis of pAdTrack-CMV-SOCS2 restrictive digestion by Bgl and Xho. 4.3.3重组质粒 pAd-SOCS2的筛选和鉴定用 Pme I 酶切测序真确的 pAdTrack-CMV-SOCS2重组质粒， 并用 CaCl2法将线性化的 pAdTrack-CMV- SOCS2质粒转化入 BJ5183感受态细胞，BJ5183含有穿梭质粒和重组所需要的酶， 37倒置培养 20 h，观察并挑取生长良好的单克隆(如图 4-7)。图 4-5 pAd -SOCS2 的筛选图 4-5 Selection of pAd-SOCS2 质粒小提法提取 pAd-SOCS2质粒(如图 4-8A)，PCR扩增得到大小约为650 bp的片段(如图 4-8B)，Pac酶切重组质粒游离出一条4.5 kD 的片段(如图 4-8C)， 与预期结果一致。 鉴定正确的质粒测序， 测序结果与 Genbank公布序列 (No. NM_007706.3) 100%同源，pAd-SOCS2质粒构建成功，测序与比对结果见附录1。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 15 页 - - - - - - - - - 第四章SOCS2 腺病毒载体的构建13 图 4-6 pAd- SOCS2 质粒及鉴定A. pAd- SOCS2 质粒； B. pAd- SOCS2的 PCR 鉴定； C. pAd- SOCS2的 Pac酶切鉴定Fig. 4-6 Plasmid of pAd- SOCS2 and identification of pAd- SOCS2A. pAd- SOCS2 plasmid; B . PCR product analysis of pAd- SOCS2; C. Identification of pAd-SOCS2 by Pac restrictive digestion 4.3.4 pAd-SOCS2的包装pAd-SOCS3 质粒转染 HEK293 细胞， 24 h后可观察到绿色荧光蛋白的表达(图 4-8A)，转染 3d 细胞中的荧光增强，数量增加(图 4-8C)。转染 6d 部分细胞出现明显的肿胀、变圆、等病变现象即 CPE现象，转染 7 天由于部分细胞病变释放病毒感染周围细胞，可观察到荧光成束存在 (图 4-8D)，转染 10 天大部分细胞出现病变 (图 4-7)。图 4-8 重组腺病毒pAd- SOCS2的包装 (100) A-F ：转染pAd-SOCS2 的 HEK 293 细胞Fig.4-8. Adenovirus packaging of pAd- SOCS2A-F: HEK 293 cells transfected by pAd-SOCS2.4.3.5 Ad-SOCS2的扩繁与滴度测定A. F. E. D. C. B. 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 15 页 - - - - - - - - - HEK293 细胞铺满 90%时，用包装的病毒原液Ad-SOCS2感染细胞。 24 h 后观察细胞内 GFP 表达， 3-4d 细胞出现明显病变时，收取细胞，-196(液氮)和 37反复冻融 5次，离心收集上清液继续感染HEK293 细胞，重复 3 次。随着扩繁次数增多，病毒滴度增大，细胞出现病变的时间缩短。 最后用 TCID50法测定扩繁病毒液的滴度， 达到 1 1010PFU/mL。图 4-9 Ad-SOCS2扩繁图片A.第一次扩繁 (100)；B.第三次扩繁 (40)；C.细胞病变图片 (100)；Fig.4-9 Amplification of Ad-SOCS2A: The first amplification; B: The third amplification; C.CPE of cell. 4.4 讨论在无细胞因子或激素诱导刺激的细胞中，SOCS蛋白以较低的水平存在。 为进一步研究 SOCS2对 GH 信号通路的调控作用，我们选择构建SOCS2腺病毒载体。与其他载体相比，腺病毒载体对宿主毒性小，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(Vorburger SA and Hunt KK 2002)。另外腺病毒载体 pAdEasy 系统操作比较简单 (Luo JY et al. 2007)， 并且容易获得高纯度的病毒液。设计 SOCS2CDS 区扩增引物时，我们在下