2022年重组人RAMP_基因腺病毒载体的构建及鉴定 .pdf

受体活性修饰蛋白（receptor-activity-modifyingprotein-1 ， RAMP1） 是降钙素基因相关肽（Calcitoningene-related peptide, CGRP ） 的受体亚单位。只有RAMP-1 存在，CGRP 才能与受体结合并发挥生理作用。本研究拟构建携带人RAMP-1 基因的重组腺病毒载体，为后续 RAMP-1 基因的功能研究奠定基础。 材料与方法1.1主要材料及试剂携带目的基因人RAMP1cDNA 的质粒pcDNA3.1 -RAMP1 由 Russo 大 学 的Andrew F 教授惠赠；人胚肾293 细胞 、大肠杆菌DH5为本中心保存。 腺病毒穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV 、 骨架质粒pAdxsi （北京诺赛基因组研究中 心 有 限 公 司）， 限 制 性 内 切 酶 （New EnglandBiolabs ） ， T4DNA连接 酶（Fermentas ）， CIP酶（Promega ），质粒提取试剂盒、 DNA 纯化试剂盒、DNA 凝胶回收与纯化试剂盒（北京威格拉斯生物技术有限公司） ， Lipofectamine 2000 （GIBCO ）， 氯化铯重组人 基因腺病毒载体的构建及鉴定石蓓，宋付凯， 赵然尊 ， 刘志江， 龙仙萍， 盛瑾（遵义医学院附属医院心内科，贵州遵义 ）摘要目的构建携带人受体活性修饰蛋白（）基因的腺病毒表达载体，为进一步深入研究的功能奠定基础 。方法通过基因工程技术将基因克隆到穿梭质粒中； 双酶切穿梭质粒，将回收的片段，亚克隆至腺病毒骨架载体得到重组腺病毒质粒；重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染细胞进行包装扩增，得到重组腺病毒并进行 鉴定及滴度测定 。结果构建的重组穿梭质粒双酶切后，得到（） 和 （）两个片段；重组腺病毒质粒用 酶切得到个片段，而作为对照的空腺病毒质粒只得到个片段；重组腺病毒 鉴定可见阳性扩增条带； 病毒滴度检测达 。结论成功构建了携带人基因的重组腺病毒载体， 为进一步研究的功能研究奠定了基础。关键词 EGFP； RAMP1； 腺病毒表达载体； 基因重组中图分类号 R512.36文献标识码 A文章编号 1000-2715（2010 ） 04-0330-03Constructionand identificationof human RAMP1gene recombinantad-enovirusSHI Bei, SONG Fu-kai,ZHAO Ran-zun, LIU Zhi-jiang,LONG Xian-ping,SHEN Jin(Department of Cardiology, Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou, 563000,China)AbstractObjectiveTo construct and identify human RAMP1 recombinant adenovirus. Methods Human RAMP1 genesegmentwas subcloned into pShuttle-GFP-CMV.PShuttle-CMV-RAMP1was digested by I-Ceu +I-Scedouble enzymeand subcloned into adenovirus backbone vector to form recombinant adenovirusplasmid. Recombinant adenovirus plasmidwas transfected into 293 cell lines by liposome. Human RAMP1 recombinant adenoviruswas detected by polymerasechainreaction, the titer of virus was analyzed. Results Cloned sequence 0.8kb (RAMP1) and 5.1kb （pShuttle-GFP-CMV ） wasobtained by double enzymeafter RAMP1 cDNA segmentwas cloned into pShuttle-GFP -CMV. DNA sequencing resultsindicated that the clone location was correct. Recombinant adenovirus plasmid was cut into seven fragmentswhile emptyvector gained only six fragmentsafter digestedby XhoI. RAMP1cDNA (0.8kb) wasamplified by PCRwith virus titer of 4.51011PFU/ml. Conclusions The recombinant adenoviruscontaining human RAMP1 gene wasestablished successfully. Thewill be helpful for further study of the function of humanRAMP1.Key words receptor activity modifying protein-1 ； recombinant adenovirus； construction_收稿日期 2009-10-20 ； 修回日期 2010- 0624基金项目 国家自然科学基金项目 （）作者简介 石蓓（） ， 女， 教授，硕士生导师， 主要研究方向， 血管再狭窄的基础与临床研究。遵义医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE ZUNYI第 33 卷第 4 期2010 年 8 月Vo1.33No.4Aug. 2010330名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - （Sigma ） 。1.2腺病毒穿梭质粒pShuttle- GFP-CMV-RAMP1的 构 建 及 鉴 定含 人 RAMP1 基 因 的 原 始 质 粒pcDNA3.1-RAMP1用 Hind III Xba I 双酶切后回收0.8kbp RAMP1 cDNA 片段；穿梭质粒 pShuttle-GFP-CMV 用 EcoRI+Xho I 双酶切后回收5.1kbp 载体片段； 再将两个片断用T4DNA 连接酶进行连接， 得到重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1。连接产物转化入感受态大肠埃希菌DH5 ，筛选 pShuttle-GFP-CMV-RAMP1转移质粒的阳性克隆，进行经酶切鉴定 。初步鉴定正确的阳性克隆并北京诺赛基因组研究中心有限公司行测序。1.3重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-CMV-RAMP1的构建及鉴定通过对腺病毒骨架载体pAdxsi 进行 I-Ceu I+I-Sce I 双酶切；同样的方法对穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1行双酶切后获取CMV-RAMP1 片断；体外应用T4DNA 连接酶对两者进行连接，获得重 组 腺病毒 质粒 pAdxsi -GFP -CMV -RAMP1。将该质粒转化感受态大肠埃希菌DH5 ， 经抗性筛选后， 提取质粒行酶切鉴定。1.4重组腺病毒Ad-GFP-RAMP1的鉴定根据RAMP1cDNA 的碱基序列， 设计了 RAMP1 的寡聚核苷酸引物，进行 PCR。 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析。1.5重组腺病毒Ad-GFP-RAMP1扩增及纯化应用 PacI 限制性内切酶将鉴定正确的携带目的基因的腺病毒质粒pAdxsi-GFP-CMV-RAMP1线性化，通过 LipofectamineTM2000 转染 293 细胞 。通过反复冻融转染的细胞并离心收集含有病毒的上清液，保存于 -80 。获取的病毒上清液应用CsCl 密度梯度超速离心进行纯化。1.6重组腺病毒Ad-GFP-RAMP1病毒滴度的测定在 96 孔板中应用半数组织培养感染量（Mediantissue culture infective dose ,TCID50）法1计算病毒滴度。 结果2.1重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1的酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1 经过双酶切后，得到与预期结果一致的 800bp （RAMP1）和 5100bp （pShuttle-GFP -CMV）两个片段，说明重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1 构建成功（图 1 ）。2.2重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1的DNA 序列测定重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-RAMP1 的 DNA 测 序 结 果 证 实 插 入 到 pShuttle-GFP-CMV 穿 梭 质 粒 中 的 人 RAMP1 基 因 序 列 与InternetGeneBank 中 公 布 的 人RAMP1基 因（NM_005855）序列完全相符合。2.3重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-RAMP1的鉴定重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-RAMP1用 Xho I 酶切得到 14500、 11700、 3500， 2660、 2470、 1450、 600bp7个片段（图 2 ） ， 而作为对照的空腺病毒质粒只得到14500、 11700、 4000， 2470、 1450、 600bp 6 个片段 （图3 ）， 与预期结果一致，表明重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-RAMP1 构建成功 。2.4重组腺病毒Ad-GFP-RAMP1的 PCR鉴定及病毒滴度测定通过对Ad-GFP-RAMP1和原始质粒图 重组穿梭质粒酶切电泳图： （ ）；：图 重组腺病毒质粒的 酶切电泳图： （ ）；：空载体图 空载体 酶切电泳图遵义医学院学报33 卷331名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 的 DNA 进行 PCR 鉴定，结果表明两者均可见164bp阳性扩增条带， 而空病毒载体Ad-GFP 没有条带，证实重组腺病毒Ad-GFP-RAMP1获得成功 。 经多次重复感染及纯化病毒后， 应用 TCID50 法测定病毒滴度达 4.5 1011PFU/mL。 讨论研究发现降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related pep tide ,CGRP), 作为一种含有37 个氨基酸的神经肽 ,在心血管系统中发挥重要的作用,参与了血管的舒张的调节, 血管平滑肌细胞增殖的调控及保护血管内皮细胞等生理功能的调节。然而，CGRP生理作用的发挥需要与其相应的受体相互作用。受体 激 活 修 饰 蛋 白 1(receptor-activity -modifyingprotein-1 ， RAMP1)是 CGRP受体的一个活性亚单位，只有它的存在才能发挥CGRP 的功能 。目前针对RAMP1 的研究，主要集中在高血压2、 偏头痛3等方面， 然而其联合CGRP 对血管平滑肌细胞增殖、 凋亡及血管再狭窄等相关的研究，少有报道 。因此，为了进一步深入研究RAMP1 的功能，本研究构建了携带人 RAMP1 的腺病毒载体 。目前用于基因治疗的载体分为两类：病毒载体和非病毒载体 。 其中腺病毒载体具有以下优点46： 腺病毒载体可感染多种哺乳动物细胞，对于细胞是否处于分裂期要求不严格；转移效率高；容量大， 可插入外源基因的片段达7 8kb； 腺病毒载体感染细胞后，携带的外源基因不整合到宿主染色体中， 而是在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，因而没有激活原癌基因或灭活抑癌基因的危险性， 具有较低的遗传毒性；制备简单， 且可通过超离心得到高滴度病毒载体，贮存方便 。因而，腺病毒载体成为基因治疗应用中最为广泛的病毒载体之一 。目前， 腺病毒载体已发展到了第三代。1995年 Mitani 等7构建了最早的第三代腺病毒载体，他们用报告基因替换腺病毒基因组中Ll、 L2 等必需区域， 用野生型腺病毒做辅助病毒，成功包装出具有同样转导性的病毒，重组病毒结构稳定且可以扩增及纯化。1998 年， He 等8首先建立了在细菌内进行同源重组腺病毒系统，该方法是在大肠杆菌内通过同源重组构建重组腺病毒质粒载体，经酶切线性化后再转染腺病毒包装细胞系(如：HEK293 等 )， 从而得到腺病毒感染颗粒。在该系统中穿梭载体携带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein， GFP)的报告基因，转染细胞后可于荧光显微镜下直接观察转染的效率， 非常直观 、 简便 。本研究选用经改良后的pShuttle-CMV 穿梭质粒和 pAdxsi 腺病毒骨架质粒， 通过体外连接的方法成功构建重组腺病毒Ad-GFP-RAMP1 ， 且病毒滴度达到 4.5 1011PFU/mL。与传统的腺病毒载体构建方法相比，该系统具有以下优点：pShuttle-CMV 和pAdxsi 质粒上有特异而且惟一的I-CeuI和 I-SceI限制性内切酶位点，避免了基因组之间的非特异性重组，提高了重组腺病毒质粒的阳性率。pShuttle-CMV 上的 1 个 Xho酶切位点与pAdxsi 上的 6 个Xho酶切位点配合使用，为重组腺病毒质粒的鉴定、 筛选和纯化提供方便。 经酶切鉴定的重组腺病毒质粒转染293 细胞，包装产生的重组腺病毒可以省却细胞内同源重组法必须进行的多轮的空斑纯化工作 。因此，改良的体外连接法在重组腺病毒质粒的构建中具有很大的时效优势。本研究通过pAdxsi 腺病毒载体包装系统成功的构建了携带RAMP1 基因的腺病毒载体， 该种方法简化了实验步骤， 缩短了病毒构建周期，并可获得高效价的重组病毒， 从而为进一步深入研究RAMP1 功能奠定坚实的基础。参考文献 ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：， ，： ， ，（）： ， ，（）： ，（）： ， ，（）：责任编辑： 谭秀荣石蓓等重组人 RAMP-1 基因腺病毒载体的构建及鉴定332名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -