2022年面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程 .pdf

河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 1 页 共 11 页面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程姓名：孙晓晴学号：2008011107 年级：2008 级专业：生物技术指导教师：边艳青2010-12-25 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 2 页 共 11 页面包酵母的诱变选育、培养基优化及发酵过程孙晓晴 2008011107 （河北师范大学生命科学学院生物技术专业石家庄 050000 ）【摘 要】发酵工程是生物技术的五大技术之一, 是生物技术的重要组成部分,是生物技术产业化的重要环节, 它是微生物学、生物化学和化学工程学有机的结合的后续课程 , 发酵工程实验是配合发酵工程教学开设的一门课程。根据课程特点, 本学期发酵工程实验内容为模拟整个发酵过程, 从菌种选育开始 , 经过培养基的优化 , 发酵过程控制 , 最终确定面包酵母突变株的最适生长培养基、生长规律、pH变化规律以及溶氧规律等。【关键词】面包酵母 ; 诱变育种 ; 培养基优化 ; 发酵酵母生产是发酵工业的一个重要组成部分, 目前世界酵母年产量约200 万吨,主要应用于食品工业 , 面包酵母是其中最典型的一种。酵母菌通常形成球形或椭圆形, 对制作面包而言椭圆形的品种为最佳, 俗称真酵母菌。面包酵母是在制备焙烤产品时常用的一种添加剂, 它利用面粉中可发酵性糖产生的CO2膨胀面团的体积, 通过面团体积的膨胀来改良面团的组织结构并改善面包的风味。因此, 选育优良的面包酵母菌种有着巨大的社会经济效益。我国在面包生产中存在的问题之一是生产周期长（一般为 8-12 小时）, 生产效率低 , 与国外先进的生产方法相比, 有较大差距。本实验在改良面包酵母菌种的基础上 , 对培养基进行优化 , 对发酵过程进行全面合理控制, 从而进一步完善面包酵母的发酵工艺。1. 材料1.1 菌种面包酵母（来自边老师提供）1.2 培养基1.2.1PAD培养基马铃薯（去皮） 200g, 切成小块 , 加 1000mL 水, 煮沸 1h, 用双层纱布滤 ,取出滤液 , 加葡萄糖 20g 使其完全溶解 , 加水定容到 1L,pH 自然。 若为固体培养基 , 则加琼脂 20g/L 。1.2.2发酵培养基经过 2.2 优化步骤选出的最优培养基配方, 在文章中会介绍到。1.3 试剂琼脂; 葡萄糖 ; 酵母膏 ; 蛋白胨 ;(NH4)2SO4; 自来水1.4 器材及用具名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 3 页 共 11 页分析天平、普通光学显微镜、高压灭菌锅、震荡培养箱、恒温培养箱、培养皿、超净工作台、发酵罐、蒸汽发生器、空气压缩机等 ; 锥形瓶、枪头（蓝、黄） 、移液器、涂布棒、试管、血细胞计数板、计数器、酒精灯等。1.5 发酵罐发酵罐的结构包括罐体、挡板、搅拌、空气分布系统、热交换系统、蒸汽系统等。不同的系统作用不同, 且为稳定发酵条件起到重要的作用。2. 试验方法本实验以小组为单位自行设计实验流程。2.1 诱变选育菌种采用物理因子紫外线诱变面包酵母,DNA 能够强烈吸收紫外线, 尤其是碱基中的胸腺嘧啶 , 从而形成二聚体 , 改变 DNA结构, 引起基因突变。再筛选有利突变菌株进行培养。常用的是 15瓦的低功率紫外灯 , 其波长集中在 253.7nm,距离常用 34cm,时间几十秒到几分钟不等。2.1.1 培养基配制及无菌物品准备配制 PAD固体培养基、液体培养基 , 准备培养皿、试管、 9ml 无菌水试管、涂布棒、枪头等包好 , 置于高压灭菌锅中 ,121 ,20min 灭菌。打开超净工作台紫外灭菌 30min。2.1.2 制备菌悬液在超净内 , 取 1ml 菌悬液加入盛有 9ml 无菌水的试管中 , 计数。 顺序依次进行 10-110-8稀释。2.1.3 涂布法接种选取上述稀释好的浓度为10-6和10-7的菌悬液 , 各吸取 0.5ml 涂布在固体平板培养基上 , 每个稀释度涂 15 板, 保证每个固体平板培养后菌落数在3080个, 以便菌落计数和菌落形态观察。做好标记。2.1.4 紫外诱变本实验设计了 0s、30s、60s、90s、12s 五个诱变剂量 , 将上述培养基分组置于超净工作台内 , 每个稀释度作 3 个平行。由于紫外线的穿透能力很差,因此要打开平皿盖 , 按照五个诱变剂量进行紫外照射诱变。标记。在培养箱中 28倒置培养 12 天。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 4 页 共 11 页诱变时间稀释度0s 30s 60s 90s 120s 10-61 2 3 10-71 2 3 2.1.5 突变菌株的筛选将培养好的培养皿进行菌落计数和形态观察, 找出菌落生长状态最好的平板, 记下稀释度和诱变剂量。 在无菌条件下挑单菌落 , 接液体培养基 ,28 震荡培养 3 天, 挑选生长好的菌液 ,4 冰箱保存 , 备用。2.2 正交试验设计优化培养基正交试验设计（ Orthogonal experimental design ）是研究多因素多水平的设计方法 , 它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验,这些有代表性的点具备了 “均匀分散 , 齐整可比” 的特点 , 是一种高效率、 快速、经济的实验设计方法。 本实验设计四因素三水平即L9(34) 来筛选最优培养基配方。2.2.1根据问题和实际要求确定影响因子及影响因子水平, 列出因子水平表。影响因子影响水平酵母膏蛋白胨葡萄糖pH 1 0.5% 0.5% 2.0% 5 2 1.5% 1.5% 4.0% 6 3 3.0% 3.0% 6.0% 7 2.2.2根据因子水平表设计正交表。No. 酵母膏蛋白胨葡萄糖pH 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 对照1% 1% 2% 6.4 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 5 页 共 11 页2.2.3根据正交实验设计表进行试验。2.2.3.1培养基配制及无菌物品准备配 方 基 础 为 ： 酵 母 膏 (1%); 蛋 白 胨 (1%);(NH4)2SO4(0.5%); 葡 萄 糖(2%);pH=6.4 。将上述基础药品配制成10 倍母液 , 每种培养基配 30ml,按比例加入母液。 最后调 pH。 另按配方基础配一组培养基作为对照组。将培养基和所需用具包好, 进行湿热灭菌 ,121 ,20min 。2.2.3.2接种待培养基冷却至60左右时 , 无菌条件下 , 每管培养基接种1ml 菌悬液。28摇培 17h。2.2.3.3计数及级差分析将上述培养好的10 种培养基的菌液稀释到合适浓度后进行计数和级差分析 , 筛选出最适面包酵母生长的培养基配方, 作为优化培养基 , 用以进行发酵。2.3 分批发酵名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 6 页 共 11 页2.3.1熟识发酵罐结构2.3.2发酵前准备按照最优培养基配方配制培养基：酵母膏 20g、蛋白胨 10g、葡萄糖 40g、(NH4)2SO4 5g 、pH=6.4。把配好的培养基倒入发酵罐中定容至12 L。2.3.3分批灭菌2.3.3.1盖好罐盖 , 对成拧紧螺丝 , 温度控制改为手动控制 ; 2.3.3.2开排气阀门 402, 开阀门 403排夹套冷却水 , 关闭其他阀门 ; 2.3.3.3开启搅拌 ; 2.3.3.4开蒸汽阀门202, 夹套进汽 , 待排水出口有蒸汽排出时, 关小阀门403,进行培养基预热 ; 2.3.3.5当培养基温度达到98时, 停搅拌 , 开蒸汽阀门 201, 微开阀门 401,关小阀门 402; 2.3.3.6调节蒸汽阀门 201、202,使罐温稳定在 120124。开始计时 ; 2.3.3.7取样阀灭菌 , 开蒸汽阀门 203, 半开阀门 405,缓慢旋开取样阀 ; 2.3.3.8旋松接种口盖 , 有少量蒸汽冒出即可。灭菌维持2030min; 2.3.3.9灭菌结束。旋紧取样阀门, 关闭阀门 405、203, 开 402、关闭 401; 2.3.3.10关闭蒸汽阀门 202、403; 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 7 页 共 11 页2.3.3.11关闭 201, 当罐压接近 0.05Mpa时, 开空气流量计针阀 , 开阀门 102, 空气进入罐内 , 调节排气阀门 402, 控制罐压 ; 2.3.3.12开进水阀门 302、404, 该温度控制为自动控制 , 开始冷却。冷却到设定温度, 备用。2.3.4发酵罐接种接种前 , 用 75% 酒精棉球对接种口消毒, 然后火焰环放置在接种口处, 按10% 接种量将种子液迅速倒入发酵罐内。2.3.5发酵过程监控在发酵过程中 , 每隔 30min, 记录发酵液的 pH值和溶氧 (Do) 值, 并每隔 1h用试管在取样口处取样 , 对菌液进行计数。2.3.6结束发酵停止发酵后 , 对发酵液和冷却水进行放罐, 仔细清洗发酵罐和电极 , 重新安装备用。3. 结果与讨论3.1诱变育种结果由下表可以看出 , 经过诱变后 , 酵母菌的死亡率非常高, 部分平板的结果甚至是100% 。 可能是由于计数时出现失误, 经稀释后菌的浓度过低 , 大剂量的诱变对菌体伤害作用很大 , 导致死亡。只有在 10-6浓度、30s 诱变剂量下出现了符合要求的突变菌株。诱变时间稀释度0s 30s 60s 90s 120s 10-61 46 2 1 1 0 2 39 0 0 1 0 3 17 0 0 0 0 10-71 19 1 1 0 0 2 13 1 0 0 0 3 17 0 0 0 0 死亡率（ % ）0 97.7 98.9 98.9 100 3.2正交试验设计优化培养基结果3.2.1正交结果（级差分析法）级差 R 的大小代表影响因素对菌体生长的影响水平大小, 级差越大 , 说明该因素对菌体繁殖的影响越大, 即为主要影响因素。根据级差R的大小确定主次因素的次序, 可知四因子对菌体生长繁殖的影响程度依次为酵母膏蛋白胨 pH 葡萄糖。据 K值的大小确定最适宜的配比, 最大的 K值对应最好的水平。对照组最终的菌液浓度为6.87108个/ml ，3、4、6、7、8、9 组的菌液浓度均大于对照组。因此 , 本组的最适培养基配方组成为：酵母膏3% 、蛋白胨 3% 、葡萄糖 4% 、pH=5 （如下表所示）。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 8 页 共 11 页No. 酵母膏蛋白胨葡萄糖pH 菌液浓度（108个/ml ）1 1 1 1 1 4 2 1 2 2 2 6.57 3 1 3 3 3 7.5 4 2 1 2 3 8 5 2 2 3 1 6.25 6 2 3 1 2 8.75 7 3 1 3 2 8 8 3 2 1 3 8.2 9 3 3 2 1 12 K16.08 6.67 6.98 6.75 K27.67 6.61 7.77 7.77 K39 9.42 7.25 7.9 级差 R 2.98 2.75 0.78 1.15 3.2.2各影响因子的影响趋势3.2.2.1酵母膏不同含量酵母膏的 K值变化6.087.67902468100.51.53酵母膏（ %）K值根据 K 值的变化趋势，可以看出酵母膏含量越大， k 值越大，即菌体生长越旺盛。且K 值有继续增大的趋势，说明还可以增大培养基中酵母膏的含量。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 9 页 共 11 页3.2.2.2蛋白胨不同含量蛋白胨的K值变化6.676.619.4202468100.51.53蛋白胨（ %）K值3.2.2.3葡萄糖不同含量葡萄糖的K 值变化6.987.777.256.577.58246葡萄糖（% ）K值3.2.2.4pH 不同 pH的K值的变化6.757.777.966.577.58567pHK值由 K值的变化趋势可以看出， 蛋白胨含量在0.5%1.5%范围内时 ， 菌 体 繁 殖 速率 缓 慢 ； 在1.5%3% 范围内，随着蛋白胨含量的增加，菌的生长水平也越来也好。按照该趋势， 还可以继续增加蛋白胨的含量。根据 K 值大变化趋势可以看出，葡萄糖含量在2% 4% 范围内，随着葡萄糖含量的增多，酵母菌生长越旺盛；而在4% 6% 范围内，酵母菌的生长速度则随着葡萄糖含量的增多而下降。说明4% 是葡萄糖的最好水平。由图可以看出， K 值随着 pH的增大而逐渐增大，在 67 范围内趋势变缓。即酵母菌的生长随pH的增大而越来越旺盛。该结果与实际酵母菌在其生长最适pH范围的生长趋势不符，可能是由于培养基中糖含量高造成的。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 10 页 共 11页3.3分批发酵结果周期菌数( 个/ml) pH Do(%) 0h 4.8251066.09 100 0.5h 5.5 1066.01 83.3 1.0h 5.94 79.4 1.5h 7.4 1065.87 79.4 2.0h 5.80 78.1 2.5h 1.27 1075.70 77.0 3.0h 5.59 72.0 3.5h 1.93 1075.44 65.0 3.3.1发酵过程中生长曲线面包酵母生长曲线4.8255.57.412.719.3051015202500.51.52.53.5时间（ h）菌数（106个/ml）3.3.2pH曲线发酵过程中 pH变化曲线6.096.015.945.875.85.75.595.4455.25.45.65.866.200.511.522.533.5时间（ h）pH由图可以看出，随着发酵时间的增长，酵母菌的繁殖速度越来越快，从延迟期阶段过渡到对数生长期初期阶段。由于营养物质丰富，细胞生长不受限制，细胞浓度呈指数增长，比生长速率会在对数期中期达到最大值。由图可以看出，随着发酵时间的增长，发酵液的 pH值逐渐变小。排除杂菌污染的可能，主要是由酵母菌生长代谢和培养基成分的改变引起的。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 11 页 共 11页3.3.3溶氧变化规律发酵过程中溶氧变化曲线10083.379.479.478.1 77726502040608010012000.511.522.533.5时间（ h）溶氧（%）4. 实验中存在的问题及改进措施整个实验分三次完成 , 流畅性很好 , 总的来说是比较成功的。但由于时间等客观条件限制的原因 , 实验中出现了一些问题。主要问题及改进措施如下：4.1 紫外诱变育种过程死亡率过高由于初始菌悬液浓度计算失误, 使得涂布接种到培养基上的菌数过少 , 再经紫外照射 , 导致部分平板上无菌落生长, 即菌的死亡率为 100% 。改进为了降低诱变后的死亡率, 可以改为先按诱变剂量诱变初始菌悬液,之后再计数 , 进行梯度稀释 , 再涂布接种 , 可以提高存活率。4.2 培养基优化过程影响因子的梯度范围相差不大, 不能全面反映影响程度的总体趋势。且只进行了这一次实验 , 存在较大误差。改进设计影响因子的范围梯度时, 应先设计较宽范围 , 得出大体影响程度趋势, 再一步一步进行细化 , 逐步得到最优水平的培养基配方。还应设计 23 个平行 , 以减小实验误差。4.3 发酵过程由于受到时间的限制, 实验并没有涉及到发酵的全过程, 菌体的生长只度过了延迟期 , 进行到了对数期的初期 , 不能得到酵母菌的完整的生长曲线, 实验的完整性不好。改进合理利用课余时间 , 安排学生参观发酵设备和体验发酵过程, 使同学们能接触到发酵的每一个时期, 了解整个发酵周期的调控, 加深对发酵技术的理解。5. 研究展望发酵工程是一门具有悠久历史, 又融合了现代科学的技术, 是现代生物技术的组成部分。现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产, 还包括微生物机能的利用 , 其主要内容为生产菌种的选育, 发酵条件的优化与控制 , 反由图可以看出，随着发酵时间的增长，发酵液的溶氧量降低速度先是很快，然后缓慢，之后又加快。菌体浓度直接影响发酵液的溶氧量，因此，随着菌体的浓度的增大，溶氧量逐渐降低。且菌体的自身代谢对溶氧量也有很大的影响。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 12 页 - - - - - - - - - 河北师范大学发酵工程实验：面包酵母的诱变选育、培养及优化及发酵过程2010 年 12 月 25 日第 12 页 共 11页应器的设计及产物的分离、 提取与精制等。工业生产上常用的微生物包括细菌、放线菌、霉菌和酵母等。在目前能源、资源紧张, 人口、粮食及污染问题日益严重的情况下 , 发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一, 得到越来越广泛的应用 , 而其中酵母菌的发酵技术更是迅猛发展, 有着广阔的发展前景。参考文献1边艳青 . 发酵工程实验指导 . 河北师范大学生命科学学院,2008. 2 姜天笑 , 肖冬光 , 刘青, 胡娅兰. 快速发酵面包酵母菌株的选育. 食品研究与开发,2006. 3曹军卫 , 马辉文 , 张甲耀 . 微生物工程 ( 第二版 ). 科学出版社 . 4刘如林 1995微生物工程概论 . 天津：南开大学出版社 . 5束强民 , 陈孝民 , 颜方贵 . 面包酵母菌种改良的研究进展. 食品与发酵工业.1996. 6百度百科 , 百度文库 , 谷歌搜索 . 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 12 页 - - - - - - - - -