小鼠部分组织的石蜡切片制作.doc

小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理:利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状.用旋转切片机可将其切为极薄的薄片,经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构.二、材料与用具1材料：小鼠肝脏、脾脏等。2用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等.三、实验内容与步骤1取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组织块.用先用0。85的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取,以免组织自溶或上皮剥落.取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1,固定时间2 hr以上,超过24hr时可继续浸泡或转入70酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称,材料的种类，动物品种及开始固定的时间。2冲洗固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液.3脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水,脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来,使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入,为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精,因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水.脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡.脱水过程要逐级上升，不能操之过急,跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形.脱水所用的酒精浓度及过程如下：3050-70-80%90-95100%（）100(）组织块在各级较低浓酒精（小于70%)中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为612 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理,以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点,故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在1530 min左右.在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50:1.简化步骤如下：70（一夜)80%（1 hr)90(30分）-95（30分)-100（15分） 酒精+ 二甲苯(15分）-二甲苯（3分) 石蜡+ 二甲苯（30分)-石蜡（80分）4透明透明是石蜡切片法切片前必经的一步.其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精,以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等,这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短，一般在20 min即可。透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1 hr左右，然后取出放入纯二甲苯中20 min即可。5浸渗浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中,然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程.石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉胶切片法是使火棉胶渗到组织间隙中去.在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中,使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为4550之间，硬蜡熔点为5658之间，6062的硬蜡很少用。冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡.浸渗应在自动恒温箱中进行。组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下：软蜡1            30min软蜡2            30min硬蜡1            3060min硬蜡2            60120min这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。浸蜡的总时间一般为：0。5立方厘米的组织块时间为68 hr；0。20。3立方厘米的组织块时间为35 hr；0.10.2立方厘米的组织块时间为23 hr。当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用.浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分,此时需要在浸蜡一次.6包埋包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中,石蜡包埋法如下。浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内，然后从第四个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向。放好组织后可以自然冷却,也可以放入冷水中直接冷却。7修块和切片取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下,用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块（每块组织占一块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切到组织。把有组织的蜡块修成正方形或梯形。在进行塑型时一定要注意组织块切面的方向。蜡块塑好后将其粘在小木块上。注意要粘牢。最后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。切片时采用手摇连续切片机。使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上，调好距离和所要求的切片厚度，然后用右手摇动手柄,即可进行切片了.一般来讲生物切片的厚度在510微米。对于切下的切片不要用手去取,因为体温可以使蜡片粘到手上，正确的做法是用毛笔或牙签挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。8展片和粘片切下的组织蜡片往往带有皱褶,所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片,即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上.展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的5658的石蜡切片的温水进行展片，4852的石蜡切片用35的温水进行展片.等到蜡片充分展平后,取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油,然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正,放到格盘内，置38温箱中烘干，然后即可进行染色.展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能染上色,组织切片内部的结构也往往被破坏。9染色和封固采用苏木精伊红对染法(HE)染色结果是细胞核为紫色,细胞质为粉红色；苏木精伊红染色法整个染色过程如下：取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右,这个过程称为脱蜡.脱完蜡后的切片即可进行染色,具体染色过程和时间如下:(1）100酒精洗去二甲苯25min.（2)95酒精25min。(3）90酒精25min.（4）80酒精25min。（5）70酒精25min。(6）50%酒精25min。（7）蒸馏水洗25min.(8)苏木精染液1020min。(9)普通水洗1min.（10）盐酸酒精分色数秒半 min(70酒精100 mL盐酸1 mL），分色到切片为带粉红色后立即取出。（11）自来水冲洗数 hr。镜检切片呈清朗的蓝色,细胞核非常明显。（12）蒸馏水洗1min。（13）50酒精25min.(14)70%酒精25min.（15）80酒精25min.（16)伊红酒精溶液对比染色25min（95酒精0。5g伊红)。(17）95%酒精25min.（18）无水酒精3min。（19）无水酒精3min。（20）无水酒精加等量二甲苯2min。(21）二甲苯数 min到透明为止.(22）自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片中央。（23)取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片，树胶即迅速扩张到四周,校正好盖玻片方向。将封好的切片放置在恒温箱中干燥。最后，将干燥好的切片上的浮色擦净,并在玻片的左端粘上标签,注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。四、显微摄影封片完全凝固后,放在显微镜下观察，选择较好的切片在尼康显微镜下进行拍摄，图像保存为jpg格式文件。五、实验结果在观察到的小鼠肝组织中，细胞核被染为蓝色,细胞质被染为红色