第19章-生物技术药物制剂.doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date第19章-生物技术药物制剂第十九章 生物技术药物制剂第十九章 生物技术药物制剂第一节 概述一、生物技术的基本概念 生物技术或称生物工程（biotechnology），是应用生物体（包括微生物、动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。 生物技术药物是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品。采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，也称为生物技术药物。 近十几年来，生物技术在医药方面取得了惊人的成就，已有不少生物技术药物应用于临床，下面介绍一些国内外已批准上市或正在研究的生物技术药物产品。二、生物技术药物的研究概况 生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40余种，见表19-1，正在研究的有数百种之多，部分正在研究的生物技术或其他来源的药物列于表19-2中，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。表19-1 已批准上市的生物技术药物产品药品名称用 途批准时间人胰岛素糖尿病治疗药1982人生长激素（hGH）治疗侏儒症1985-2b干扰素治疗毛细胞白血病、乙型肝炎1986OKT3单抗（小鼠抗T细胞单抗）急性肝移植排斥反应1986乙肝疫苗预防乙型肝炎1986组织溶纤酶原激活素急性心肌梗死1987人促红细胞生成素（EPO）慢性肾衰贫血1987-lb干扰素慢性肉芽肿疾病1990GM-集落刺激因子（GM-CSF）骨髓移植中性、白细胞减少症1991G-集落刺激因子（G-CSF）肿瘤化学辅助治疗、白血病、艾滋病1991白细胞介素-2肾细胞癌1992凝血VIII因子血友病1992人肿瘤坏死因子突变体肺、胃、结肠肿瘤1995幼畜腹泻疫苗预防仔猪腹泻上市-n3干扰素生殖器疣1989小鼠抗 CD3抗体肾移植排斥反应1986单克隆抗体（诊断剂）结肠、直肠、卵巢癌诊断1992重组DNA酶囊性纤维变性，改进胸功能1994抗血小板凝聚单克隆抗体防动脉突然关闭高危性血管成形术病人1995重组葡糖脑苷脂-米葡糖脑酶戈谢病（各器官积聚葡糖脑苷脂）1994重组-16干扰素缓解上皮癌、肾癌、多发性骨髓瘤1993环孢素 A抑制T淋巴细胞功能1996降钙素治疗骨质疏松1996重组-干扰素免疫功能障碍、癌症、感染性疾病1992奥曲肽（octreotide）胃肠胰内分泌肿瘤、消化性溃疡出血、肢端肥大症、垂体瘤、柯兴氏综合症、糖尿病等1998*grlanulocytemacrophage colonystimulating factor（GMCSF），粒-巨噬细胞集落刺激因子表19-2 部分正在研究的生物技术及其他来源的蛋白质药物药 物作用与用途血管紧张素 D抑制剂降压心房肽激素（atriopeptins）调节心血管功能降钙素基因相关因子血管舒张药-内啡肽镇痛神经生长因子，hNGF刺激神经生长和修复，痴呆促胃液素抑制剂减少胃酸分泌脑啡肽刺激淋巴细胞母细胞化促胸腺生成素选择性T细胞分化激素肿瘤坏死因子控制多形核细胞功能表皮生长因子，hNGF促进表皮生长，痴呆生长抑素（somatostatix）抑制胃液素分泌促性腺素促进排卵、精子生成促黄体生成素释放激素（LHRH）促进下丘脑性闭经妇女排卵催产素促进分娩促甲状腺素释放激素（TRH）延长哺乳期妇女的不育和泌乳加压素治疗尿崩症人尿激酶原溶血栓，抗凝剂人超氧化物歧化酶肾移植，烧伤白细胞介素-6肿瘤、骨髓移植，刺激造血白细胞介素-11促血小板生成链激酶，LSK溶血栓人成纤维细胞生长因子神经损伤人胰岛素生长因子侏儒症肝细胞生长因子重型肝炎肝癌单克隆抗体肝癌乙肝单克隆抗体乙肝反义寡聚核苷酸HIV感染和艾滋病TK载体产生细胞脑癌巨核细胞与发育因子刺激血小板生成脂质体包被 IL-2，OTX-287肿瘤抗 CD20 基因工程抗体B细胞淋巴瘤表19-2中所列药物，如环孢素 A（cyclosporin A）、降钙素（calcitonin）、促黄体生成素释放激素（luteinizing hormone release hormone，LHRH）类似物、催产素、加压素等，用提取或其他方法生产，已在临床上使用。 随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给药物制剂带来了新的挑战。由于生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性质很不稳定，极易变质，因此如何将这类药物制成安全、有效、稳定的制剂，就是摆在我们面前的一大难题。例如降钙素基因相关肽是治疗高血压的有效药物，但该药物很不稳定，虽然早已开发，但由于存在以上问题，至今未形成产品。另一方面这类药物对酶敏感又不易穿透胃肠粘膜，故只能注射给药，使用很不方便。因此，运用制剂手段将这类药物制成口服制剂或通过其他途径给药，以提高其稳定性和患者使用的顺应性，是一项非常有意义的工作，具有潜在的研究价值和广阔的应用前景。三、生物技术药物的结构特点与理化性质 生物技术药物多为多肽类及蛋白质类药物，这些药物的化学结构相当复杂，理化性质也有它的特殊性，因此在设计与评价这类药物的给药系统时必须首先了解其结构特性与理化性质。 （一）蛋白质的结构特点 1蛋白质的组成和一般结构 蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质分子量很大，一般在5×1035×106。蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成和二硫键的位置等。组成蛋白质的氨基酸有20多种，一个氨基酸的羧基可以和另一个氨基酸的氨基缩合失去1分子水而生成肽，两个氨基酸缩合成的肽称为二肽，由十个以上氨基酸组成的肽称多肽。连接氨基酸之间的键称为酰胺键，又称肽键，是蛋白质中氨基酸之间连接最基本的共价键。蛋白质多肽链中许多氨基酸按一定的顺序排列，每种蛋白质都有特定的氨基酸排列顺序。蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构。一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置；二、三、四级结构为高级结构或空间结构。高级结构和二硫键对蛋白质的生物活性有重要影响。 2蛋白质的高级结构 蛋白质的高级结构包括二级、三级与四级结构。二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有a螺旋结构与b折叠形式。三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合方式系一条多肽链中所有原子的空间排布。四级结构是指具有三级结构的蛋白质各亚基聚合而成的大分子蛋白质。四级结构可以由两个以上的小亚基聚合而成。所谓亚基，就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价键相联，每一条多肽链都有自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚单位（亚基）。蛋白质高级结构见图19-1。图19-1蛋白质高级结构见 药剂学第4版图20-2图19-1 蛋白质高级结构示意图 蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象（conformation）时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力（hydrophobic force）、离子键、范德华力、二硫键与配位键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。蛋白质分子二级结构中a螺旋、b折叠的形成依靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。疏水作用力也称疏水键，疏水键是两个疏水基为了避开水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构方面起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。范德华力对稳定和维持三级、四级结构十分重要。 离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子通过配位键与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非氨基酸成分通过配位键组成。 （二）蛋白质的理化性质 1蛋白质的一般理化性质 蛋白质的分子量，小的有几千，如胰岛素（单体6000）；大的上千万，如斑纹病毒（烟草）（6´107）。蛋白质在水中形成亲水胶体，颗粒大小在l nm 100nm之间。它不能透过半透膜。由于蛋白质分子中存在极性基团如-NH3+、-COO-、-NH2、-OH、-SH等，可形成水化层而稳定。 （1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。 （2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。 （3）蛋白质两性本质与电学性质：蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的e-氨基，谷氨酸的羧基等。这些基团在一定 pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同 pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子。 2蛋白质的不稳定性 蛋白质的稳定性对于蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮存等极为重要。引起蛋白质不稳定的原因很多，如前所述，共价键与非共价键的破坏与生成，均可引起蛋白质类药物的不稳定。 （1）由于共价键引起的不稳定性：共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解、氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换。有时几种反应同时进行。虽然大多数降解过程在升高温度时发生，但是蛋白质稳定性监测数据表明其降解过程不符合 Arrhenius关系，故蛋白质类药物稳定性的加速实验中应慎重选择其最高温度。如白细胞介素-l（interleukin-1）在溶液中高于和低于39时存在不同的失活机制，此实例排除了从加速温度数据预测处方有效期的可能性。但文献报道组织溶纤酶原激活素（tissue plasminogen activator）在40和40以下的稳定性研究中成功地将数据外推到5。蛋白质的降解途径有： 1）蛋白质的水解：蛋白质可被酸、碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐渐变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。水解分完全水解与不完全水解。完全水解是在5.7molL盐酸中，于110高温20h可完全变成氨基酸。在此条件下，能使色氨酸破坏，谷氨酰胺变为谷氨酸，天冬酰胺变为天冬氨酸，后二者的水解作用也叫脱酰胺作用（deamidation）。酸水解可使胱氨酸变成半胱氨酸，丝氨酸、苏氨酸也有不同程度的破坏。不完全水解是在酶或稀酸等较温和的条件下进行，水解产物有肽段与氨基酸。蛋白质在4.2mol/LnaOH溶液中水解10h，使蛋白质完全水解，碱水解对半脱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸等有破坏作用，同时使各种氨基酸发生消旋。 2）蛋白质的氧化：蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸，如甲硫氨酸、半胱氨酸可以在一些氧化剂的作用下氧化，甲硫氨酸可氧化成甲硫氨酸亚砜而使一些多肽类激素和蛋白质失去活性。半胱氨酸的巯基根据不同的反应条件，可依次氧化为次磺酸（RSOH）、二硫化物（RSSH）、亚磺酸（RSO2H），最后成磺酸（RSO3H）、半胱氨酸，即半胱磺酸。影响氧化的因素有温度、pH值、缓冲介质、催化剂的种类和氧的强度等。巯基的氧化在碱性条件下，特别是在金属离子（如Cu2+）的存在下容易发生。 3）外消旋作用（racemization）：某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型化合物转变为D-型和L-型各50的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH值、离子强度和金属离子螯合作用。蛋白质中氨基酸的消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式（nonmetabolizable forms）。 4）二硫键断裂及其交换：二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键。它是由两个半胱氨酸侧链上的-SH巯基脱氢相连而成。二硫键把同一肽链（肽链内）或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。在某些蛋白质中，二硫键一旦破坏，蛋白质的生物活性即丧失，蛋白质分子中二硫键数目愈多，则结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强。蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性。二硫键交换（bisulfide bond exchange）可由硫醇类催化，如下式所示：HSR RSSR RSSR十HSR有人证实核糖核酸酶（ribonuclease）在90加热去活化作用就是二硫键交换所致，这个过程由于硫醇类物质如半胱氨酸的存在而加速。 （2）由非共价键引起的不稳定性：引起蛋白质不可逆失活作用的下列主要类型，即聚集（aggregation）、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性，这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起，这些现象在开发蛋白质与多肽类药物制剂中常会带来许多困难。 （三）蛋白质类药物的评价方法 在前面讨论蛋白质药物不稳定的原因时已经看出，要开发蛋白质类药物，需要多种分析方法。 1液相色谱法 液相色谱法是评价蛋白质的纯度与稳定性的常用方法。在蛋白质分析中通常采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、离子交换色谱法（IEC）与分子排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）。反相色谱法是以非极性固定相与含水的极性流动相为基础的分析方法，对于大分子蛋白质，以C4或 C8烷基键合于硅胶上或聚合物担体上作固定相，固定相应有较宽范围的孔体积（直径约300nm或更大），以便分子量约为5000或更大的蛋白质能够充分扩散到固定相骨架中。流动相一般用不同浓度的乙腈水溶液，并含有离子对试剂，如三氟醋酸（0.1），磷酸盐或缓血酸胺缓冲液用以调节pH以获得最佳分离效果。应用反相 HPLC法，由于有机溶剂、疏水的相互作用及分离时所用的低pH值，会使一些蛋白质变性。然而该方法对几种蛋白质特别有用，并被广泛应用于胰岛素制剂的质量分析。药典中胰岛素一般用生物效价法测定，因此在使用时应建立RP-HPLC与生物效价法之间的相互关系。RP-HPLC还应用于疟疾蛋白抗原（malaria protein antigens）、白细胞介素-2、突变蛋白（muteins）、人生长激素及重组人体干扰素制剂稳定性的检测。离子交换色谱法用于从N-末端甲硫氨基型分离重组白介素-l。分子排阻色谱可以测定-干扰素、白介素-2在升温贮存、机械搅拌后及快速冰冻熔化后的聚集情况。 2光谱法 通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外（UV）、可见吸收光谱、旋光色散（ORD）、圆二色谱（CD）、荧光、红外（IR）和拉曼（Raman）光谱。紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度。蛋白质在230280nm间的吸收是由酪氨酸（Amax=274nm）、色氨酸（Amax=280nm）、苯丙氨酸（Amax=254nm）、芳环侧链所决定。当蛋白质在溶液中聚集时，由于光散射，在310400nm处有一倾斜基线，这使得吸收测定倾向于280nm。光散射可测定制剂中蛋白质的聚集数量，散射强度是单位体积散射中心数的函数。在450nm处测定牛生长激素的浊度可用以评价其不同折叠构象的溶解度。浊度的测定仅限于颗粒比光波长小的情况，此时浊度才与聚集程度呈线性关系。蛋白质的远紫外圆二色谱直接反映蛋白质的二级结构，一种不对称分子如蛋白质大分子可显示圆二色谱。这项技术可用于测定蛋白质二级结构的变化与稳定性、热处理或冰冻与熔化之间的函数关系。有人用远紫外CD法研究了牛生长激素分离片段的螺旋结构。发现螺旋量依赖于pH值及肽的浓度。 3电泳 电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生特征性迁移，迁移率是所带净电荷及其大小的函数，以此来分离混合蛋白质。在蛋白质的分析中广泛使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电点聚焦（isoclectric focusing，IEF）和新的毛细管电泳（EC）法。SDS-PAGE电泳先用SDS阴离子表面活性剂使样品变性，随后通过聚丙烯酰胺担体进行电泳。本法用于测定蛋白质亚单位组成和分子量，可取得满意效果。 4生物活性测定与免疫测定 重组DNA和杂交瘤技术产品应进行生物活性的测定，蛋白质药物制剂的稳定性也应检测其生物活性。生物活性检测是利用体内模型或体外组织或活性蛋白质多肽的特异性生物学反应，通过剂量（或浓度）效应曲线进行定量（绝对量或比活性单位）。用理化方法代替生物活性测定时，需建立两种方法之间的相关性。生物活性测定是制订这类药物制剂质量标准的最基本方法。免疫测定通常是采用免疫化学法，例如一种蛋白质与含适当比例的特异抗体血清，即免疫血清（用动物免疫所得）混合，则会形成沉淀，这种建立在沉淀反应基础上的免疫化学方法非常适合于蛋白质的定性及定量分析、蛋白质制剂（混杂有其他蛋白质）的均一性试验以及蛋白质混合物组分的鉴定。这种方法也可作为蛋白质结构研究的辅助手段。与其他方法相比较，主要优点是可用于定量化学分析不能检测的情况，例如测定蛋白质混合物的一种组分。第二节 蛋白质类药物制剂的处方与工艺蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题。对于注射给药则采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺，而非注射给药还需解决生物利用度问题。本节主要讨论这类药物的注射剂型。一、蛋白质类药物的一般处方组成目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂。溶液型使用方便，但需在低温（28）下保存。冻干粉型比较稳定，但工艺较为复杂。二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化在液体剂型中蛋白质类药物的稳定化方法分为两类：改造其结构；加入适宜辅料。改变蛋白质结构，如改变蛋白质一级序列、改变取代反应官能团和化学修饰的方法，以提高蛋白质空间伸展自由能，改变与溶剂接触的性质，该方法不属于制剂学范畴，故在此不做详细讨论。通过加入各类辅料，改变蛋白类药物溶剂的性质是药物制剂中常用的稳定化方法。蛋白类药物的稳定剂有以下几类： 1缓冲液 因为蛋白质的物理化学稳定性与pH值有关，通常蛋白质的稳定pH值范围很窄，应采用适当的缓冲系统，以提高蛋白质在溶液中的稳定性。例如红细胞生成素采用枸橼酸钠-枸橼酸缓冲剂，而-N3干扰素则用磷酸盐缓冲系统，人生长激素在5mmolL的磷酸盐缓冲液可减少聚集。缓冲盐类除了影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶解度与聚集均有很大影响。组织溶纤酶原激活素在最稳定的pH条件下，药物的溶解度不足以产生治疗效果，因此加入带正电荷的精氨酸以增加蛋白质在所需pH值下的溶解度。 2表面活性剂 由于离子型表面活性剂会引起蛋白质的变性，所以在蛋白质药物，如-2b干扰素、G-CSF、组织溶纤酶原激活素等制剂中均加入少量非离子表面活性剂，如吐温80来抑制蛋白质的聚集，其机理可能是因为表面活性剂倾向于排列在气液界面上，从而使蛋白质离开界面来抑制蛋白质的变性。 3糖和多元醇 糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂。蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇（浓度1%10%）最常用。糖和多元醇的稳定作用与其浓度密切相关，不同糖和多元醇的稳定程度取决于蛋白质的种类。还原糖与氨基酸有相互作用，因此避免使用。 4盐类 盐可以起到稳定蛋白质的作用，有时也可以破坏蛋白质的稳定性，这主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷。低浓度的盐通过非特异性静电作用提高蛋白质的稳定性。如SO42-、HPO42-、CHCOO-、（CH3）N+、NH4+、K+、Na+等能增加溶液的离子强度，提高疏水作用，降低疏水基团的溶解度，使蛋白质发生盐析。此外它们使水分子聚集在蛋白质周围被优先水化，所有这些都使蛋白质更加紧密稳定。经常使用的盐NaCl在稳定蛋白质中起关键作用，实验表明它能提高牛血清白蛋白（BSA）的变性温度和热焓。 5聚乙二醇类 高浓度的聚乙二醇类常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀结晶剂。研究表明不同分子量的PEG作用不同，如PEG300浓度0.5%或2%可抑制重组人角化细胞生长因子（rhKGF）的聚集；PEG200、400、600和1000可稳定BSA和溶菌酶。 6大分子化合物 研究表明很多大分子化合物具有稳定蛋白质的作用。其机制可能是通过大分子的表面活性、蛋白质-蛋白质相互作用的空间隐蔽以及提高粘度来限制蛋白质运动或通过优先吸附于大分子以起到稳定作用，人血清白蛋白（HAS）已在许多蛋白质类生物技术来源的药物制剂中作稳定剂。近年来也有采用环糊精制成包合物来增加蛋白质药物的溶解度，例如用2-羟丙基-b-环糊精是较有前途的稳定剂，其本身又是增溶剂可静脉注射，可用来抑制hGH的界面变性，抑制rhKGF的聚集，稳定白介素-2和牛胰岛素等。 7组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等 可不同程度地抑制45 10 mM磷酸盐缓冲液中rhKGF的聚集。 8金属离子 一些金属离子，如钙、镁、锌与蛋白质结合，使整个蛋白质结构更加紧密、结实、稳定。不同金属离子的稳定作用视离子的种类、浓度不同而不同，应通过稳定性实验选择金属离子的种类和浓度。三、固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺蛋白质类药物的非注射给药存在生物利用度低等问题，因此目前多以注射途径给药。在一些蛋白质药物不能采用溶液型制剂时，往往用冷冻干燥与喷雾干燥的工艺使形成固体状态以提高这类制剂的稳定性，关于冷冻干燥及喷雾干燥的一般工艺过程在本书的第四章中已有论述，下面仅就蛋白质类药物的特殊性作一说明。 （一）冷冻干燥蛋白质药物制剂用冷冻干燥法制备蛋白质类药物制剂时主要考虑两个问题，一是选择适宜的辅料，优化蛋白质药物在干燥状态下的长期稳定性。二是考虑辅料对冷冻干燥过程中一些参数的影响，如最高与最低干燥温度，干燥时间，冷冻干燥产品的外观等。虽然冻干可以使蛋白质药物稳定，但不应忽略有些蛋白质药物在冻干过程中反而失去活性，主要原因是：从液态到固态的相变过程中，包在蛋白质周围的水分子被除去而失活；高浓度的盐和缓冲组分的结晶或缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化、浓缩时蛋白质有限的溶解度等均能导致蛋白质药物失活。在选择冻干制剂的缓冲体系时，要考虑到温度对pH值和溶解度的影响。在蛋白质类药物冻干过程中常加入某些冻干保护剂来改善产品的外观和稳定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等。溶液中的成分也可以影响冷冻干燥过程中与热有关的工艺参数。冻干过程中与热有关的性质有：制剂的冷冻温度、有可能使饼状物熔化或坍塌的温度及有可能使产品发生降解的温度。控制这些参数，使产品冷冻适度，饼状物不融化、不坍塌也不降解，DSC是表征与优化冻干工艺有用的技术。在冻干过程中还应考虑药物的含水量与饼状物的物理状态（无定性或晶形）。其物理状态与冷冻过程的温度及添加剂有关。无定形的水分含量一般较高，这是因为在干燥过程中水蒸气的蒸发减慢的缘故。水分的增加会降低饼状物的物理稳定性并可能导致贮藏过程中饼状物的坍塌。此外水分也可以影响蛋白质的化学稳定性。因此，严格控制产品的含水量，对保证产品的质量是十分重要的。 （二）喷雾干燥蛋白质药物制剂喷雾干燥工艺广泛应用于蛋白质类药物的控释制剂、吸入剂、微球制剂等新型给药系统的研制中。在喷雾干燥过程中可加入稳定剂，如蔗糖能提高氧血红蛋白（oxyhemoglobin）的稳定性。喷雾干燥的缺点是操作过程中损失大（特别是小规模生产），水分含量高。但只要精心控制工艺参数，选择适合稳定剂，可生产出粒径为3mm 5mm，水分含量为56的活性产品。第三节 蛋白质类药物新型给药系统一、新型注射（植入）给药系统临床经验表明，很多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，因而需要延长其在体内的平均驻留时间，或改变蛋白质在体内的药物动力学性质，有时需要制成非零级脉冲式释药系统（如疫苗）。为满足这些要求，既可以对蛋白质分子进行化学修饰，也可以控制蛋白质进入血流的释放速度等。目前已有用PEG修饰蛋白质分子以延长蛋白质药物在血浆中的半衰期。例如 PEG与蛋白质连接分子变大而不易被肾小球滤过，或者由于蛋白质的代谢和排泄所需的细胞受体的相互作用受到空间位阻。腺苷酸脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）即采用形成PEG-ADA这种方法，治疗因ADA缺乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已经获FDA批准生产 （一）控释微球制剂为了达到蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂，目前已经实际应用的生物可降解材料有聚乳酸（PLA）或聚丙交酯乙交酯（poly(lactide-co-glycolide)，PLGA）。PLGA也可叫聚乳酸乙醇酸共聚物（copoly(lacticglycolic) acid），改变丙交酯与乙交酯的比例或分子量，可得到不同时间生物可降解性质的材料。首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林（leuprolide acetate）聚丙交酯乙交酯微球。此种微球供肌内注射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达30d之久，改变了普通注射剂需每天注射的传统，使用方便。用于制备生物大分子药物控释微球的方法很多，根据不同性质的载体材料可选择不同的制备方法。如相分离凝聚法、乳化蒸发法、复乳液中干燥法、低温喷雾提取法、喷雾干燥法以及超临界萃取法等，参见第十六章第四节。以下介绍几种常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的方法。 1复乳液中干燥法 将药物与保护剂（多为水溶性高分子聚合物）溶于水作为水相，将聚酯（如PLA、PLGA等）类高分子材料溶于二氯甲烷作为油相，两者在一定温度下（低于40）高速搅拌得W/O型初乳，冰浴冷却至10以下，倒至一定浓度的PVA水溶液中，经高速搅拌得W/O/W型复乳，一定温度下搅拌蒸去有机溶剂固化微球（或减压去有机溶剂），离心水洗，真空干燥即得。该方法是制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的常用方法，其特点为药物包封率较高，药物活性损失小，设备和工艺简单，但首日突释明显，较难放大生产，目前用此法研究制备的药物有干扰素、白细胞介素、亮丙瑞林、人生长激素、环孢素以及促红细胞生长素（EPO）等。 2低温喷雾提取法 将生物大分子药物与保护剂的均匀粉末加至生物可降解性聚合物的有机溶剂（如二氯甲烷）中混合形成混悬液，将此混悬液经喷头雾化后喷入冰冻的乙醇溶液（该溶液可与上述溶液混溶，但聚合物不溶于此溶液），在低温（-70）状态下，聚合物载体中的有机溶剂在乙醇中不断扩散完全，分离微球，低温干燥除去乙醇得粉末状微球，该方法的特点：包封率高，微球粒径集中，工艺稳定，可实现产业化，但其活性损失较复乳液中干燥法大。 3喷雾干燥法 将生物大分子药物及其稳定剂的混合粉末（或水溶液）与溶有高分子聚合物的有机溶液混合形成混悬液（或乳浊液），将此混悬液（或乳浊液）经喷嘴雾化干燥制得微球。为了减少生物活性损失，文献报道采用双喷嘴喷雾干燥装置进行生物大分子药物微球的制备，可明显增加微球的收率，同时可减少多肽、蛋白质类药物的活性损失。该装置具有两个平行喷嘴，其中一个喷嘴喷出药物和聚合物的混悬液（或乳浊液），另一喷嘴同时喷出5%的甘露醇溶液，将微球包层，这样可避免普通喷雾干燥装置制备微球过程中易粘附器壁的缺陷。 4超临界萃取法 超临界萃取技术是从20世纪80年代逐渐发展起来的一门新技术。近年来，超临界萃取技术已在化工、冶金、食品、医药、生物等领域得到广泛应用。超临界流体既具有对溶质有较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性。更重要的是在临界点附近，压力和温度微小的变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现为溶解度的变化。因此，人们可以利用压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程而成为实现药物多组分分离的一种有效方法。人们将此技术应用于微粒给药系统，制备药物的控释聚合物微球、药物结晶的粉末、控释脂质体药物等。在制备微粒中根据聚合物及药物的溶解特性又分为超临界溶液快速膨胀（rapid expansion of supercritical solution，RESS）技术和气体反溶剂（gas antisolution，GAS）技术。RESS技术的操作过程是：将固体物质在一定的温度和压力下溶解在超临界流体中形成溶液，然后将此高压溶液从一个细小的喷嘴（一般喷嘴的内径为几十微米，长约几个毫米）喷射到常压的空间中，由于超临界流体在减压的过程中变成了气体，溶解在其中的溶质就沉淀析出，产生直径从几百纳米到几个微米左右的颗粒。一个典型的成功例子是包埋在聚乳酸小球中的Lovastatin晶体。颗粒的构型可以通过适当改变压力、温度、溶液浓度以及喷嘴几何形装来调节。因此用RESS技术得到的固体颗粒都在微米级而且粒径分布比较均匀。GAS技术是将溶质先溶解在某种有机溶剂中，然后将此溶液与超临界流体混合。由于有机溶剂可溶于超临界流体而溶质不溶，于是溶质析出形成微粒。由于液态二氧化碳对于有机溶剂具有溶解性，将药物与高分子材料溶解于有机溶剂中，将此溶液与液态二氧化碳混合，载有药物的高分子材料则析出形成微球。 Raouf G等采用超临界流体技术的RESS法和三种聚酯类高分子材料（DL-PLGA、L-PLA、DL-PLA）制备了氢化可的松微球，三种材料制得的微球均小于10m，采用N2和CO2混合物比单用CO2可取得更高的分散度，空白微球和包封氢化可的松的微球的粒径大小无明显变化，氢化可的松收率为40%。【实例1】亮丙瑞林微球的制备：通过复乳液中干燥法制备。取醋酸亮丙瑞林500mg，明胶80mg，水lml，混合加热至60为内水相，油相为PLA或PLGA 400mg溶于二氯甲烷5.5ml，然后将油相在搅拌或超声处理逐渐倒入水相中制成WO微乳剂，此乳剂冷却至15，在5000rmin下用喷嘴加入到400m1，0.5的聚乙烯醇水溶液中搅拌2min使成（WOW）乳剂。将此（WOW）乳剂在30下缓慢搅拌2h或旋转蒸发除去二氯甲烷，得硬化的圆形微球（或微囊）。粒径为5m 100m，平均粒径20m。药物含量约10，体内外释放见表19-3。表19-3醋酸亮丙瑞林体内外释放与PLGA（7525）平均分子量（12000）的关系时间d体外释放体内释放剩余醋酸亮丙瑞林PLGA平均分子量剩余醋酸亮丙瑞林PLGA平均分子量010012000100120007701050079105001457940060880021375600375000282150003028003502600202200表19-3说明醋酸亮丙瑞林随PLGA降解分子量下降而不断释放，在体内外大体一致，体内能维持一个月。【实例2】白细胞介素1（IL-1）PLGA微球的制备：Limor Chen等以改良的复乳溶剂挥发法制备。具体方法为：将含有20mg牛血清白蛋白（BSA）和8.5g IL-1的水溶液50l与含有200mgPLGA的二氯甲烷0.5ml混合，用探针式超声乳化（56w）30s，将此初乳分散于1ml用二氯甲烷饱和的1%（w/v）PVA水溶液中，漩涡混悬形成复乳，再将该复乳倾入50ml 0.1%（w/w）PVA水溶液中搅拌5min，再加入50ml含有10%（v/v）2-丙醇的PVA溶液将二氯甲烷抽提到外水相中，连续搅拌30min后，离心10min收集微球，冰冻干燥成流动性粉末状微球。由于皮下注射微球后小于10m微球易被巨噬细胞吞噬，故需将微球粒径控制在10m以上。制备过程中界面张力影响IL-1的活性，加入0.5%（w/w）磷脂酰胆碱（PC）可保护IL-1，并显著减小微球的粒径。微球的体外释放度试验表明，牛血清白蛋白和白细胞介素1在30min钟内分别释放38%和63%，40d内分别释放75%和100%。扫描电镜显示，突释后的释药过程与骨架的溶蚀过程同时进行。 这类制剂，尽管发展前景广阔，但仍存在许多问题，主要是由于在体内多聚物降解而产生的酸性环境降低了蛋白质分子的稳定性，因此如何加入弱碱性添加剂以保持多聚物在降解过程中的蛋白质分子的稳定性是目前此类产品亟待解决的问题。 （二）脉冲式给药系统肝炎、破伤风、白喉等疾病所用预防药物，即疫苗或类毒素均为抗原蛋白，使用这些疫苗全程免疫至少要进行三次接种，才能确保免疫效果。由于种种原因，全世界不能完成全程免疫接种而发生的辍种率达70%，因此为了提高免疫接种的覆盖率，减少重大疾病的死亡率，采用脉冲式给药系统将多剂量疫苗发展为单剂量控释疫苗，例如将破伤风类毒素制成PLGA脉冲式控释微球制剂，可根据PLGA中乳酸和羟乙酸的比例不同、分子量不同以及制备的微球大小不同，一次注射该制剂1d14 d、l个月2个月与9个月12个月内分三次脉冲释放，可达到全程免疫的目的。此项研究，目前正在进行中。二、非注射给药系统研究非注射途径的给药系统，将有益于增加病人的顺应性（compliance）。蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式包括鼻腔、口服、直肠、口腔、透皮和肺部给药。目前最有应用前景的属鼻腔给药，然而口服给药还是最受欢迎的给药途径，但难度很大。蛋白质类药物非注射给药系统存在的主要问题是药物穿透粘膜能力差，易受酶的降解，以致生物利用度很低。为了提高这类药物制剂的生物利用度，一般采用以下方法：对药物进行化学修饰或制成前体药物；应用吸收促进剂；使用酶抑制剂；采用离子电渗法皮肤给药。以上几种方法中吸收促进剂应用最多。吸收促进剂的种类因给药途径不同而异，但其作用机制一般有以下几种：增强药物的热力学运动，使药物不易聚集，溶解性增加，易于吸收，如水杨酸钠能增加胰岛素的热力学运动，因而有利于吸收；改变上皮细胞的体积，使细胞间转运更易