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Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date翻译好的-罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、 器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 l 20×DAB+1L 30%H2O2+94 l PBS）、Proteinase K工作液（10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。三、 实验步骤操作流程图：制作石蜡切片脱蜡、水合细胞通透加TUNEL反应液加converter-POD与底物DAB反应显色光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在2137°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400g/mL）处理5 分钟。其它替代方法： 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法 1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法 2： 将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）替代方法 3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。5. PBS漂洗2次；6. 制备TUNEL反应混合液：处理组用50l 1号液+450l 2号液混匀；而阴性对照组仅加50l 2号液，阳性对照组先加入100l DNase 1，反应在1525×10min，后面步骤同处理组。7. 玻片干后，加50l TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50l 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37×1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450500nm，检测波长为515565nm）；10. 玻片干后加50l 3号液（converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37×30min。11. PBS漂洗3次；12. 在组织处加50100l DAB底物，反应1525×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4保存；适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min；PBS浸洗二次，每次5min；将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100中处理5min；PBS浸洗二次，每次5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6-15四、 注意事项1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用8090%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 2号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20（-1525）；3号液（converter -POD）液一旦解冻，以后就保存在4（28）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。现象可能原因建议非特异性染色TdT酶的浓度过高用TdT dilution buffer* 作12110稀释TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂）尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用）确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液采用推荐的固定液固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭标记率低如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。固定时间过长，导致交联程度过高减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定荧光淬灭Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭，需注意避光操作促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低1、 增加通透剂促渗时间2、增加通透剂的作用温度（15-25）3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min）4、0.1M的柠檬酸钠70作用30min。荧光背景很高支原体污染请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染TdT酶的浓度过高或反应时间过长用TdT dilution buffer* 作12110稀释或注意控制反应时间红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。阳性对照没有信号DNase I的浓度过低1、 冷冻切片使用3u/ml的DNase I2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I 3、 一般样本使用10u/ml DNase I组织样本从载玻片脱落组织样本被酶从玻片消化下来降低蛋白酶K的处理时间常见问题的原因及推荐解决方案TdT dilution buffer：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol-