细胞的原代培养.doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date细胞的原代培养细胞原代培养小鼠胚胎成纤维细胞的培养细胞原代培养【实验目的】1. 理解细胞原代培养原理2. 熟悉细胞原代培养方法与过程3. 了解细胞原代培养的应用 4. 独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、 原代培养实验原理 细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。原代培养的方法有：a. 组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks液洗涤23次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。b. 酶消化法: 将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入1030ml的0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化2030分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 510分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养 。 【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10新生牛血清(NBS)、青霉素100 u ml 、链霉素100ugml。(2)消化液：为0.125胰蛋白酶0.02EDTA混合消化液。4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75酒精棉球，酒精灯、小指管。【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1. 取怀孕1618d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。2. 无菌条件下暴露子宫。3. 用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜， 剪断子宫角。4. 取出整个子宫，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。用PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。 5. 沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。充分洗涤，清洗表面。 6. 用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜。用PBS洗涤3次。7. 去除胚胎头部、内脏和四肢。将躯干部置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞。(二)小鼠胚胎成纤维细胞的培养：1.用无菌眼科小剪刀或剃须刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。2.室温下静置1min。弃上层液，留下胚胎组织碎块。 3.添加胎牛血清接种到培养瓶内。每5-30个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。静置5min后，倒置加入适量培养液，并倒置在37、5CO2、饱和湿度培养箱中培养。4.2-3小时后,将培养瓶翻转过来，使培养液覆盖植块。继续在37、5CO2、饱和湿度培养箱中培养。5.培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出细胞。补充培养液，继续培养，每天倒置在显微镜下观察。过4天后在倒置显微镜下观察拍片。【实验结果】图二 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养【结果分析】 从照片来看，细胞原代培养较成功，大部分细胞活性较好，呈梭形附着与瓶壁上，密度适中，死细胞较少。可继续进行后续传代培养。【注意事项】1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。3.运用消化法时胰酶温度应小于370C，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的110分钟，而是至少20分钟，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中可存活10分钟以上。如果胰酶作用过强，则这些细胞膜易被损伤而不易生存。4.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。【思考题】一、如何提高原代细胞培养的成功率？答：1. 在选择材料的时候一定要注意选取比较健康的小鼠。在处理胚胎的时候要干净利落。不要把胳膊等部位的细胞混进去了。2. 操作一定要无菌，不能污染。在剪碎细胞的时候，一定要注意尽量剪得碎一点。3. .运用消化法时胰酶温度应小于37，浓度只需平时消化细胞浓度的一半4. 如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。5. 取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。二、为克服微生物污染应采取那些措施？答：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用洗涤液拭擦双手消毒。用75%酒精擦双手、移液器消毒 。枪头要灭过菌才可用。滴管以及试管等要过酒精灯火焰。枪头伸进容器内后最好更换之后再取别的液体。要注意更换剪刀，培养皿等实验工具。不能够交叉污染。再者，不能够在实验的时候将手从实验台中拿出，随意的摸其它东西。-