溶菌酶及其在食品工业中的应用.doc

精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除溶菌酶及其在食品工业中的应用摘要：溶菌酶是一种具有天然活性，安全无毒的生物酶，可专一作用于微生物的细胞壁，从而广泛应用于食品防腐，医疗制品，机体免疫等方面。本文介绍了溶菌酶的结构、性质。对其近年来其在食品工业上的应用进行了综述， 并对其应用前景进行了展望。关键词：溶菌酶；结构性质；食品Application of Lysozyme in the Food IndustryXiong sizhouAbstract: Lysozyme was a biological enzyme of native active, safe and nontoxic, which was widely used in food preservation, medical production, body immune, etcIn this article, the structure, properties, are summarized. In recent years The application of the enzyme in food industry was also summarized. the prospect of lysozyme was predicted.Keywords: Lysozyme ; Structure and Properties ;Food1922年，英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在1。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。1 溶菌酶的分类 溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。1.1 细菌溶菌酶 细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的(14)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。1.2 真菌溶菌酶真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和-葡聚糖酶。1.2.1 几丁质酶 虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC32130)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC32114)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如 Trichoderma harzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。 1.2.2 -葡聚糖酶 -葡聚糖酶(-glucanases；EC 32139)具有抗真菌作用主要是因为它能水解(13)糖苷键。研究表明：(13)葡聚糖酶对几丁质降解真菌细胞壁具有显著的协同作用。如将纯化的几丁质酶和-葡聚糖酶合用，抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作用。因为许多植物性食品中含有-葡聚糖成分，它对维持产品的组织性、黏度和外观都有重要作用，将-葡聚糖酶加入这类食品，可能会引起不良影响。真菌的细胞壁主要组分为几丁质和-葡聚糖，但一些真菌和大多数酵母细胞壁含有其他类型的多糖(甘露聚糖、-葡聚糖和纤维素)，因此，甘露聚糖酶、-葡聚糖酶也可作为抗真菌的酶类应用于食品工业。2 溶菌酶的结构 溶菌酶相对分子质量为14.6×103，由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有4对二硫键。溶菌酶分子近椭圆形，大小4.5nm×3.0nm×3.0nm。它的构象比较复杂，螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的片层构象。不同来源的溶菌酶组成一级结构的氨基酸数量是相同的，但多肽链上某些个别氨基酸有差异，因此来源于不同种属(如噬菌体、番木瓜、鸟类、鸡、鼠、狗、人类)的溶菌酶或同一种属不同脏器(如兔的肝、脾、鼠的脾、肾)的溶菌酶分子量各不相同。1963年科学家测定了鸡蛋清溶菌酶的一级结构，它是由129个氨基酸残基组成的单一多肽链，分子中含有八个半肌氨酸，多肽链折叠使两两半胱氨基酸相互靠近形成了四对二硫键。多肽链内的35位谷氨酸残基与52位的天冬氨基酸与酶的活性有关，多肽链的氨基末端是赖氨酸残基，羧基末端是亮氨酸残基。一级结构多肽链经盘绕，折叠形成含有螺旋和片层状的二级结构。此酶的三级结构是在二级结构单元的基础上在经盘绕成紧密折叠的椭球结构；在此结构中含有三段螺旋，另有一部分自身回折成一段反平行的片层状，其余肽链为无规线圈，在此酶椭球形结构中，由于在二级结构的肽链生成后，在无规线圈处自身折叠时，几乎所有的氨基酸侧链上的极性亲水基团都朝向外，处于球形分子的表面，而几乎所有的疏水基团则避开水而聚集在分子的内部。此酶外形上有一个明显裂隙，这是溶菌酶的活性中心2。3 溶菌酶的作用机制溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAGC1和NAMC4之间的（1-4）糖苷键2。几丁质是甲壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由NAG残基通过（1-4）糖苷键连接而成，几丁质也是溶菌酶的底物。溶菌酶的内部几乎全部是非极性的。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的-1.4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于革兰氏阳性菌（G+），如藤黄微球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，与革兰氏阴性菌(G-)，如大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对于破坏G+细菌的细胞壁较G-细菌强。4 在食品工业中的应用由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒副作用，因此被认为是一种很安全的食品添加剂。由于其具有选择性抑菌的特点，目前已被许多国家和组织批准为食品防腐剂或保鲜剂使用。广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐;还可以添加入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。食品腐败时，早期出现的微生物通常是该食品特有的微生物。如果通过某种手段杀死或抑制这些特定微生物生长，便能延长食品的保质期。近年来发现，化学合成杀菌剂都有一定的毒性，因此不宜向食品中添加。所以，用安全性高的溶菌酶进行食品防腐将与日俱增4。4.1 用于水产类制品的应用溶菌酶本身是一种无毒、无害的蛋白质，且具有一定的保健作用，可以选择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其他物质，保证食品原有营养成分不受损失。对革兰阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作用。对大肠埃希菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰阴性菌也有一定程度溶解作用。其最适作用浓度为0.05%，与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，能够有效提高其防腐效果，可用于水产类保鲜与防腐。该保鲜剂完全采用安全、无毒、天然的物质科学地配合组成，它的保质效果可以延长冷却肉的保质期14倍。该保鲜剂可以耐受95以下的温度，并保持性质稳定。因此，可以将其添加到原料肉中，进行低温加热(80左右)，使用浓度为肉重的0.050.01，使用方法为在肉块进行滚揉或进行斩拌时加入，但是要注意的问题是在低温肉制品热加工中，加工的温度不要超过95。4.2 在乳制品中的应用溶菌酶是一种非特异性免疫因子，可对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖，是婴儿食品中的抗菌蛋白，是一种必需的添加因子。溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接地促进婴儿肠道内双歧杆菌的增殖；可以促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，延长在肠道停留时问，有利于婴儿消化吸收；可以促进人工喂养婴儿肠道细菌菌群的正常化；它还能够强化血清灭菌蛋白、球蛋白等体内防御因子，以增强对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻和消化器官疾病及增加体重的功效，是婴儿食品及配方奶粉等的良好添加剂。溶菌酶特别适合于巴氏杀菌奶的防腐，一般在包装前加入300600ppm。另外，在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的后期起泡、风味变差及不影响奶酪老化过程中奶酪基液的品质，同时，还能起到抑菌作用，不至引起酪酸发酵，这是其他防腐剂所无法比拟的。另外,牛乳中溶菌酶含量远远低于人乳现在实验表明将溶菌酶添加到牛乳及其制品中!可使牛乳人乳化!可满足婴幼儿对乳制品的要求5。4.3 在酒及饮料防腐中的应用用溶菌酶代替水杨酸，用于日本清酒的防腐取得了很好的成效。清酒乙醇含量为1517(体积分数)，大部分微生物不能生存，但有一种乳酸菌则能生长，并引起产酸和产生臭味。以往通常加水杨酸作防腐剂，但因为水杨酸有一定毒性，其应用受到了限制。目前，日本已成功用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂，其加入量为15mgkg。此外，溶菌酶还可应用于pH值为6.07.5的饮料的防腐剂6。4.4 在保健功能性食品中的应用溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质，且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血作用，有组织再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。4.5 溶菌酶在其他食品中的应用奶油蛋糕是容易腐败变质的食品之一，在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，起到防腐作用。将溶菌酶应用于食物的保鲜中，其效果也极为明显。同时根据溶菌酶无毒无害且有保健作用!有抗感染和增强抗生素的效力。以及促进血液凝固及止血和组织再生作用。现在有人尝试在食品中作为添加剂增强食物的保健功效。由于处于酵母细胞壁中的蛋白质利用率很低，所以利用溶菌酶破坏酵母细胞壁，可制成微生物蛋白质，提高酵母蛋白质的利用率7。4.6 在食品软包装中的应用将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能。目前许多肉制品软包装都需要经过高温灭菌处理。经过处理的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味。溶菌酶杀菌防腐，由于不经过加热，属于冷杀菌，因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用，尤其对热敏感的物质更具有重要意义。如果在产品真空包装前添加一定量的溶菌酶(13)，然后巴氏杀菌(80100，2530min)，可获得很好的保鲜效果。此外，溶菌酶对人体安全、无毒、无害，且具有一定的保健作用。同样，果蔬加工前添加一定量的溶菌酶，一般添加量为0.10.2(拌料时添加)或13(加热煮制时添加)，都能起到很好的保鲜效果8。5溶菌酶的应用前景溶菌酶的研究与发展蕴藏着巨大的潜力，溶菌酶以其较强的溶菌性正引起各国科研人员的重视，作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，是一种安全性很高的的食品保鲜剂、营养保健品和药品；作为一种工具酶在基因工程上有着广泛的应用，而其在医学上的作用也越来越受到重视，随着科学技术的发展，我们对溶菌酶认识的加深，将会更加多方面应用其特性来改善我们的生产、生活。国内外市场对溶菌酶的需求将不断增加，然而，目前溶菌酶的高端产品主要被加拿大、美国、日本等国的大公司所垄断，我国溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，国内厂家基本上采用从蛋清中提取溶菌酶生产技术，而蛋清溶菌酶有限的溶菌谱及其较低的提取率限制了溶菌酶的应用，溶菌酶以其较强的溶菌性正引起各国科研人员的重视，目前，各国科研人员正积极在以下几个方向进行研究：(1)提高产量。酶的生产成本是其能否在工业上成功应用的关键。运用基因工程技术，结合已有的结构和功能关系的知识，进一步提高酶的产量，降低成本。(2)对产的溶菌酶组分进一步分离纯化，研究可能存在的各组分间的协同作用机制。(3)对酶的分子生物学方面的研究，克隆酶的基因，构建高表达工程菌株，进一步研究基因工程菌的发酵动力学，确定发酵动力学参数，找到反映工程菌发酵过程的平衡方程。(4)探讨酶活性位点与保守位点，通过分析酶的一级结构，阐明酶的结构与功能的关系、酶底物的专一性及结构对酶稳定性的影响。(5)对酶的作用机制的探索，弥补当前溶菌机制方面研究的空缺。(6)在对溶菌酶序列进行生物信息学分析的基础上，利用同源建模工具对蛋白质结构进行预测。参考文献1沈同,王镜岩.生物化学【M】.北京:高等教育出版社,1990:280-281.2丁昌玉.溶菌酶的结构与功能.蚌埠医学院学报1986,6(11)：243-245.3Kozo HAMAGUCHI, KATSUYA HAYASHI, TAIJI IMOTO-H and MASARU FUNATSU Strecture of Muramidase (Lysozyme) The Journal of BiochemistryJ, 1964,1(55):24-29.4 曹涛,刘同军,王艳君.微生物溶菌酶的研究及应用.中国调味品J,2011,36（3）:23-26.5 吴连春,张秀玲.溶菌酶的研究与应用.科技传播2011,7(上):108-1106叶丹,连宾.溶菌酶及其应用.贵州科学J,2003,21(3):67-707 林翠花,肖素荣, 孟庆国. 溶菌酶结构特点及其应用.潍坊学院学报2005,32(5):108-110.8 赵红艳，王爱军.溶菌酶及其在食品工业中的应用.职业与健康J 2008,1, 1(24):74-75. 【精品文档】第 6 页