基因工程-第一章-核酸的制备ppt课件.ppt
Chapter 1 Preparation of nucleic acid核酸：遗传信息的储存物质脱氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid, DNA核糖核酸：ribonucleic acid, RNA区别：第一节 天然DNA的制备（Preparation of DNA）一、DNA的组成与结构（ Composition and Structure of DNA）:A phosphate group linked by a phosphodiester bond to a pentose (a five-carbon sugar molecule)that in turn is linked to a nitrogen- and carbon-containing ring structure commonly referred to as a “base”.BasePentosePhosphate GroupNucleotide主要碱基的化学结构：结构：DNADNA解链温度（Tm，melting point）DNA分子杂交(Hybridization of DNA strands from different sources)环状DNA（Circular DNA）超螺旋DNA（supercoiled DNA ，SC-DNA）；共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）；开环DNA（open circle DNA，oc-DNA）；线形DNA（linear DNA，L-DNA）二、天然DNA的提取（Purification of DNA）(一)生物材料的准备（Preparation of Material）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（ Ethanol ）1.2.TE溶液（Tris-Cl 10 mmol/L pH 8.0， EDTA 1 mmol/L ）1.3.低温2.大肠杆菌（E. coli）常见抗生素（Antibiotics）的使用：2.1 氨苄青霉素（ampicillin，Ap）：抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，50150 g/mL（水溶液）；2.2 链霉素（streptomycin，Sm）：与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡， 2550 g/mL（水溶液）；2.3 四环素（tetracycline，Tc）：与细菌核蛋白体的30S亚单位结合，干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用，从而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合， 5 mg/mL（乙醇溶液）；2.4 氯霉素（chloramphenicol，Cm）：与细菌核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成， 20 g/mL（乙醇溶液）；2.5 卡那霉素（knamycin，Km）：与细菌核蛋白体蛋白基结合，并与较小的RNA亚基编译区的特定碱基结合，从而抑制蛋白质合成， 2550 g/mL（水溶液）；(二)裂解细胞（Cell lysis）：1.化学方法：1.1 CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethy ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），阳离子去污剂，与核酸形成复合物，在高盐溶液（ 0.7 mol/L NaCl）中稳定，在低盐溶液（ 0.3 mol/L NaCl ）中沉淀。1.2 SDS裂解法：SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠），阴离子去垢剂，蛋白质变性剂，有效沉淀多糖，与K离子形成絮状沉淀，广泛用于质粒（plasmid）DNA的提取，蛋白质的分离纯化。2.酶裂解方法：2.2 蛋白酶K（Proteinase K）裂解法：用于水解蛋白质，特别是与DNA结合紧密的组蛋白（Histone），广泛用于动物组织基因组DNA的提取，通常与SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解细胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于细菌裂解，提取质粒DNA，其原理是破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架，通过低渗透压使细胞胀裂，引起细胞裂解。作用条件温和，pH 6.07.0，室温25 。（三）DNA的分离和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（ phenol ）-氯仿（ chloroform ）-异戊醇（isoamyl alcohol ）比例：25:24:1，苯酚：蛋白质变性剂；氯仿：蛋白质变性剂；并使变性的蛋白质从水相层分离；异戊醇：防止产生泡沫。2. 氯化铯密度梯度离心法(CsCl density gradient centrifugation)；3. 固相萃取法(solid phase extraction, SPE)；离心技术在基因工程中的应用（Application of Centrifugation techniques ）（四）DNA的纯化（purification）和浓缩（condense）1. DNA的纯化：1.1 Rnase处理，去除RNA；1.2 离子交换层析法；1.3 氯化铯密度梯度离心法；1.4 琼脂糖电泳洗脱法；琼脂糖电泳（Agarose gel electrophoresis）1.安放好制胶模具（梳子和胶槽）2.琼脂糖凝胶浇灌并冷凝3.移走梳子，暴露出上样孔4.琼脂糖胶放置在电泳缓冲液中5. 上样，通电流，直至DNA迁移到适当位置6. 在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况DNA电泳完毕后的琼脂糖凝胶在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况不同凝胶的DNA电泳情况琼脂糖凝胶（agarose）聚丙烯酰胺凝胶凝胶（PAGE）电泳仪（电源和电泳槽）离子交换柱层析纯化DNA2. DNA的浓缩：2.1 乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2 正丁醇（ butyl alcohol ）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）浓缩法；第三节第三节 人工合成核酸片段人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成二、核酸的酶法合成PCR反应（反应（Polymerase Chain Reaction, 聚合酶聚合酶链式反应）：链式反应）： 模仿细胞内发生的模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外复制过程，在体外有酶催化合成特异性有酶催化合成特异性DNA片段。片段。PCR技术简史技术简史1971年，年，Khorana提出：经过提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆复该过程便可克隆tRNA基因。基因。但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及70年代基因工程技术的发明使年代基因工程技术的发明使克 隆 基 因 成 为 可 能 ， 所 以 ，克 隆 基 因 成 为 可 能 ， 所 以 ，Khorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了PCR技术简史技术简史1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等人等人发明了聚合酶链反应（发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理基本原理是在试管中模拟细胞内的是在试管中模拟细胞内的DNA复制复制最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，由于，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错出错耐热耐热DNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCR能高效率的能高效率的进行，随后进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR自动化热循环仪自动化热循环仪1993年，年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学等因此项技术获诺贝尔化学奖奖1. PCR的基本原理的基本原理(Mechanism of PCR )类似于类似于DNA的体内复制。的体内复制。其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的次循环反应，使目的DNA得以几何级数倍增。得以几何级数倍增。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。（3 3）PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR反应标准的标准的PCR反应条件：反应条件： 10X缓冲液（缓冲液（Buffer）10 L4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物（引物（Primer） 各各10100pmol模板模板DNA （Template） 0.12gTaq DNA聚合酶聚合酶 0.5 2.5UMg2+ 1.5mmol/LPCR反应1 12 23 34 45 52222555572729494时间（时间（minmin）温度温度（）PCR反应适温延伸适温延伸3 3高温变性高温变性1 1低温退火低温退火2 2重复重复1313步步25302530轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍37-60 90-9570-75 PCR 扩增No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target12243841653266420220=1,048,57630230=1.07X1071 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon PCR反应特点反应特点灵敏度高灵敏度高n皮克皮克(pg=10-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10-6)水平水平n能从能从100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞n病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3个个RFU（空斑形成单位空斑形成单位） n细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3个细菌个细菌简便、快速简便、快速n一次性加好反应液，一次性加好反应液，24 小时完成扩增小时完成扩增n扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提织的粗提DNA（1）Taq DNA聚合酶聚合酶（2） Pwo DNA 聚合酶聚合酶（3）Tth DNA 聚合酶聚合酶（4）C.therm 聚合酶聚合酶4.2.1 耐热性耐热性DNA聚合酶聚合酶（1）Taq DNA聚合酶聚合酶1986年从一种年从一种75热泉中的细菌热泉中的细菌 (Thermus aquaricus)中分离中分离纯化出来的。纯化出来的。 95kDa，单分子酶，单分子酶， 75 活性最强。活性最强。具有具有 5-3 合成活性和合成活性和 5-3 外切活性外切活性 , 无无 3-5 外切外切活性。活性。95 时半衰期为时半衰期为 40 分钟分钟。启动启动 PCR 反应的能力很反应的能力很强，聚合速度快，在强，聚合速度快，在 72 的聚合速的聚合速度为每秒度为每秒 30-100 碱基。碱基。由于没有由于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配的错配率。率。（2） Pwo DNA 聚合酶聚合酶来自来自 古细菌古细菌Pyrococcus woesei，由德国宝灵曼公由德国宝灵曼公司开发司开发（BM），）， 90kDa ，100 的半衰期大于的半衰期大于 2 小时，小时，具有具有 3-5 外切活性，出错率低外切活性，出错率低，使用较多的的且具有高保真度的使用较多的的且具有高保真度的 PCR 酶。酶。 （3）Tth DNA 聚合酶聚合酶来自嗜热热细菌（来自嗜热热细菌（Thermus thermophilus） ，由由 Promega 公司开发成商品。公司开发成商品。 p 94kDa ，p 95 的半衰期为的半衰期为 20 分钟分钟。p 在在 Mg2+ 存在条件下以存在条件下以 DNA 为模板合成为模板合成 DNA ，而在而在 Mn2+ 存在下可以存在下可以 RNA 为模板合成为模板合成 cDNA 。p 因此可在高温下做因此可在高温下做 RT-PCR （反转录（反转录PCR）反反应，应， 避免避免 RNA 反转录过程中形成的二级结构。反转录过程中形成的二级结构。 （4）C.therm 聚合酶聚合酶 p来自来自Carboxydothermus hudrogenoformans，p以以Mg2+为辅助因子的为辅助因子的逆转录酶逆转录酶，p最适温度适最适温度适60-70 ， p同时也具有同时也具有3-5外切酶校对活性外切酶校对活性，p用于用于RT-PCR 反应。反应。4.2.2 靶靶DNA/模板模板其两端其两端20-30bp序列用以一对引物的设计。序列用以一对引物的设计。避免避免引物内部或引物之间存在互补序列（引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱个碱基），基），减少引减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。4.2.3 PCR引物引物引物用引物用核酸序列保守区内设计核酸序列保守区内设计并具有并具有特异性特异性，4.2.4 PCR原材料原材料dNTP 脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸4.2.5 PCR缓冲液缓冲液成分：成分：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8室温下室温下)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2。Mg2+：是是DNA聚合酶的激活剂，聚合酶的激活剂，0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降；产量下降； Mg2+过高影响反应特异性过高影响反应特异性4.2.6 PCR循环的温度和时间循环的温度和时间温度温度:90-95 模板变性，模板变性，复性（复性（37-60 ），），；70-75 引物在模板上延伸引物在模板上延伸反应时间反应时间变性变性30 s，如果模板，如果模板 G+C 含量高，变性时间可适当延长。含量高，变性时间可适当延长。复性复性30 s。延伸延伸1kb 1 min充足，由扩增产物的大小决定。充足，由扩增产物的大小决定。 循环次数循环次数 2535 次。次。25 L PCR反应体系：反应体系：模板模板DNA 1 L （10100ng）引物引物1 1 L （10 mol/L）引物引物2 1 L （10 mol/L）dNTP（ 10 mmol/L ） 1 L （20 mmol/L）10 PCR反应的缓冲液反应的缓冲液 2.5 L Taq酶酶 0.5 L （ 1U/l）ddH2O 补至补至25 L 4.3 PCR扩增扩增DNA片段的方法片段的方法常规程序常规程序PCR反应的程序：反应的程序： 温度（温度（） 时间（分钟）时间（分钟）(1) 95 3-5 (2) 95 0.5(3) 60 0.5(4) 72 1(5) 72 102530个循环PCR反应的操作注意事项：反应的操作注意事项：1）加样操作必须在冰上进行；）加样操作必须在冰上进行；2）加样的顺序：）加样的顺序：（1）从大到小；）从大到小；（2）先加药品再酶）先加药品再酶：PCR反应结果异常及解决办法：反应结果异常及解决办法：1）无带；）无带；2）杂带多；）杂带多；3）DNA降解。降解。 PCR中应注意的事项中应注意的事项 防止污染防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作 设立对照设立对照：阳性对照：阳性对照： 阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照： 阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照： 除模板外的所有组分除模板外的所有组分4.4 PCR技术应用技术应用4.4.1 PCR技术的主要类型技术的主要类型反向PCR 锚定PCR不对称PCR 原位PCRRT-PCR 重组PCR差异显示PCR免疫PCR实时定量PCR多重PCR (asymmetric PCR) 逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增扩增5）实时定量PCR技术实时定量实时定量PCR（也称（也称TaqMan PCR, FQ-PCR）是美国是美国PE（Perkin Elmer）公司）公司1995年研制出来的年研制出来的一种新的核酸定量技术，一种新的核酸定量技术，该技术是在常规该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的。现其定量功能的。利用设计好的引物，将不同基因，或基因利用设计好的引物，将不同基因，或基因的不同区域连接起来。的不同区域连接起来。6）融合PCR技术引物（Primer）基因A基因B4.4.2 PCR技术应用 研究研究 基因克隆，基因克隆，分子检测，分子检测，DNA测序，分析突变，测序，分析突变，分子进化分子进化 诊断诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 法医法医 犯罪现场标本分析犯罪现场标本分析 医学医学 临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控 其他其他第四节 DNA序列测定（DNA Sequencing）一、DNA序列测定： 通过各种方法得知DNA一级结构各种碱基的排列顺序，是详细分析基因结构和功能的基础。二、双脱氧链终止法： 利用DNA聚合酶合成单链DNA模板互补链的性质进行测序。在dNTP中掺入一定比例的ddNTP，使延伸随机终止，并通过毛细管电泳分离各DNA片段。ddNTP
