葡萄糖氧化酶及其应用.doc

精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除葡萄糖氧化酶及其应用【摘要】:葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶,对人体无毒、副作用，广泛应用于食品、医药、饲料等行业中，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。该文从葡萄糖氧化酶的性质、生产和应用等方面对其进行了简单介绍。【关键词】：葡萄糖氧化酶 性质 生产 应用 The glucose oxidase and its application Abstract: Glucose oxidase (GOD) is an aerobic dehydrogenase. It has no side effects and non-toxicity on human. GOX，which has played an important role on removing glucose，de-oxidization and sterilization，is widely applicated in food, medicine, feed stuff and other fields. This paper reviews the property, production and application of Glucose oxidase.Key Words: Glucose oxidase property production application葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase EC 1.1.3.4.）全称为-D-吡喃型葡萄糖需氧脱氢酶，简称GOD，它能在有氧的条件下专一性将-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。早在1904年，人们就发现了葡萄糖氧化酶，但当时对其商业价值认识的不足，并未引起人们的重视。直到1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶，并进一步通过试验确定了酶的作用机理，并命名为葡萄糖氧化酶，之后把他归入脱氢酶类。葡萄糖氧化酶广泛的存在于动物、植物和微生物体内，微生物繁殖快，来源广的特点事其成为葡萄糖氧化酶的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。其广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。国外由于对葡萄糖氧化酶的研究较早，在菌种筛选、产酶条件的优化、酶的分离纯化、酶学特性以及葡萄糖氧化酶基因的克隆与表达等方面研究都已较为深入。相比国外，我国对葡萄糖氧化酶的研究工作起步较晚，从20世纪末期对其展开了较为系统的研究。我国受技术水平以及仪器设备的限制，目前生产的工业酶制剂不仅生产成本高，而且纯度以及稳定性方面都达不到要求，工业酶制剂市场基本被国外企业所垄断，而如何降低葡萄糖氧化酶的生产成本和提高其应用适应性是急待解决的问题1。1. 葡萄糖氧化酶的性质1.1 物理性质粉状的葡萄糖氧化酶呈灰黄色，液状的葡萄糖氧化酶为淡褐色，精制液体状酶为淡黄色。易溶于水，不溶于不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂，50%丙酮和66%甲醇能沉淀该酶，溶液在摇动时泡沫呈棕绿色，不能透过硝化纤维膜。固体葡萄糖氧化酶在0条件下至少能保存2年，在-15下可保存8年2。1.2 化学性质葡萄糖氧化酶相对分子质量一般在1.5×105左右，每分子酶含2分子FAD。pH作用范围3.56.5，最适pH为5.0左右，在没有保护剂存在的条件下pH >8.0或pH <3.0时会迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用温度范围一般为3060，最适作用温度为5055。葡萄糖氧化酶能高度特异性的结合-D-吡喃葡萄糖，葡萄糖分子C1上的羟基对酶的催化作用是必要的条件，而且羟基位于-位时酶的活性比位于-位时酶的活性高大约160倍。底物的分子结构在C1、C2、C3、C4、C5、C6位上的改变使葡萄糖氧化酶的活性大幅度下降，但在不同的程度上还表现出一定的活性，见表1。葡萄糖氧化酶对于L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖是完全没有活性的3。表1 葡萄糖氧化酶的底物特异性葡萄糖改性的位置化合物同-D-葡萄糖的差别相对速率-D-葡萄糖1001-D-葡萄糖C1上OH的构型0.64续表 1 葡萄糖氧化酶的底物特异性葡萄糖改性的位置化合物同-D-葡萄糖的差别相对速率22-脱氧-D-葡萄糖C2上OH被H取代3.32D-甘露糖C2上OH的构型0.9822-O-甲基-D-葡萄糖C2上OH的H被甲基取代033-脱氧-D-葡萄糖C3上OH被H取代14D-半乳糖C4上OH的构型0.544-脱氧-D-葡萄糖C4上OH被H取代255-脱氧-D-葡萄糖C5上OH被H取代0.055L-葡萄糖C5上CH2OH的构型066-脱氧-D-葡萄糖C6上OH被H取代06木糖C6被H取代0.981.2.1 葡萄糖氧化酶的作用机理葡萄糖氧化酶能利用分子氧或原子氧进行葡萄糖的氧化,消耗溶解氧,降低氧的氧化作用,从而保护食品中易氧化成分不被氧化。葡萄糖氧化酶的催化反应按反应条件有3种形式: （1）没有过氧化氢酶存在时,每氧化1分子葡萄糖消耗1氧: C6H12O6+O2C6H12O7+H2O2 -D-葡萄糖+O2-D-葡萄糖内酯+H2O2(2) 葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原酶系统，当反应体系中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时存在时，首先葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，然后过氧化氢酶催化过氧化氢生成水和氧气，最后水与D-葡萄糖酸内酯结合生成葡萄糖酸 : C6H12O6+1/2O2C6H12O7+H2O2(3) 当反应体系中葡萄糖氧化酶过氧化氢酶和乙醇同时存在时,首先葡萄糖氧化酶催化 -D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯和过氧化氢,然后过氧化氢酶催化过氧化氢和乙醇生成水和乙醛,最后水与D-葡萄糖酸内酯结合生成葡萄糖酸4。 C6H12O6+C2H5OH+O2C6H12O7+CH3CHO+H2O2研究表明，葡萄糖氧化酶催化反应的速率同时取决于O2和葡萄糖的浓度，反应遵循乒乓机理。1.2.2 温度对酶活性的影响葡萄糖氧化酶反应体系中含有气体反应物氧，所以反应温度的变化导致氧在反应体系中浓度的改变，因为温度升高时，反应体系中氧气的溶解度下降，这就抵消了温度升高对酶反应速率的影响。从表2中可以看出：其一是葡萄糖氧化酶催化的反应具有较低的Q10；其二是葡萄糖氧化酶在较宽的范围内（3060)具有活性，且差异不大。表中所列出的葡萄糖氧化酶活性是采用量压法测定30min内反应体系吸收氧气的数量而得到的3。表 2 温度对葡萄糖氧化酶活性的影响温度/O2吸收/L相对活性Q10温度/O2吸收/L相对活性Q1001540.51403301.11.1101780.591.15503141.050.95202300.771.3603061.020.97303001.01.31.2.3 pH对酶活性的影响 葡萄糖氧化酶的活性在pH为4.57.0基本上相同，变化不大，pH高于7.0或低于4.5活性急剧下降。但同样的pH条件下葡萄糖底物的存在对酶活性有保护作用，如pH在8.1时，当无葡萄糖底物的存在时，酶活性在10min内损失90%，当葡萄糖底物的存在时，酶活性在40min内仅损失20%,。低pH条件下，霉菌葡萄糖氧化酶仍然具有一定的催化活性，只是反映的速率较低，但仍然可以完成特殊的催化反应。1.2.4 酶的抑制剂 铜离子和其他巯基（SH）螯合剂能抑制霉菌产生葡萄糖氧化酶的活性，阿拉伯糖是酶的竞争性抑制剂；氰化氢和一氧化碳对酶没有抑制作用。2、 葡萄糖氧化酶的生产葡萄糖氧化酶是酶技术研究与应用领域中一种非常重要的酶，由于葡萄糖氧化酶与生命的重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了他在科研、医药和工业生产上的广泛应用。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内,但动植物组织中葡萄糖氧化酶含量有限，而微生物由于具有来源广泛、生长周期短等优点被广泛用作生产葡萄糖氧化酶的来源。但通常天然菌株产葡萄糖氧化酶水平不高，难以直接用来生产葡萄糖氧化酶。一方面我们可以通过菌株诱变、优化菌株的发酵条件等传统方法，获得葡萄糖氧化酶高产菌株;另一方面，通过基因重组等方法获得葡萄糖氧化酶高产菌株，采用重组工程菌获得葡萄糖氧化酶5。2.1 工业化生产葡萄糖氧化酶的菌株目前工业化生产葡萄糖氧化酶是利用微生物发酵法生产,可以生产葡萄糖氧化酶的微生物主要是细菌和霉菌。细菌主要有弱氧化醋酸菌等;生产上一般采用的霉菌是黑曲霉和青霉属菌株,除了黑曲霉和青霉外，拟青霉属(Paecilomyces )胶霉属( Glioctadium)及帚霉属( Scopulariopsis)等也具有产葡萄糖氧化酶的能力工业化生产葡萄糖氧化酶的主要菌种见表3。表3 工业化生产葡萄糖氧化酶的主要菌种菌属具体菌种青霉点青霉(Penicillium notatum )、生机青霉(Penicillium uital )、产黄青霉(Penicillium chrysogenum )、灰绿青霉( Penicillium glaucum)、尼崎青霉(Penicillium amagasakiense )、紫色青霉(Penicillium notatum )曲霉米曲霉( Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger )、土曲霉（Aspergillus terreus）其他菌属镰刀霉属( Fusarium)、柠檬酸霉属(Citromyces )2.2 利用菌株诱变获得葡萄糖氧化酶 对葡萄糖氧化酶生产菌株的诱变通常采用紫外诱变和化学诱变剂诱变等方法6。紫外线照射通过改变菌体DNA从而引起菌体的突变。李筱瑜等人7。将黑曲霉菌株P-采用紫外线进行诱变，得到突变菌株U-69产酶酶活是出发菌株P-的2.5倍.化学诱变是用化学诱变剂处理菌种，以诱发遗传物质的突变。化学诱变相比于紫外诱变更具定向性，化学诱变剂不同，作用的菌株、细胞及基因不同，诱变的效果也会存在差异。常用的化学诱变剂有甲基磺酸乙酯(EMS )和硫酸二乙酯(DES )等1。选择单独一种诱变方法，也可以几种方法复合使用，筛选出其中的正突变菌株，提高原始菌株产酶能力。2.3 利用基因重组技术获得葡萄糖氧化酶工业化生产中常用黑曲霉或青霉发酵来获得葡萄糖氧化酶，但黑曲霉和青霉菌发酵过程中常会伴随产生过氧化氢酶 淀粉酶等其他杂蛋白，给后期的分离纯化工作带来困难，因此用基因工程方法构建更优良的葡萄糖氧化酶生产菌株一直受到各国科学家的注视。将葡萄糖氧化酶的基因进行克隆，连接相应的表达载体后转化基因工程菌株，通过诱导表达葡萄糖氧化酶基因来获取大量的葡萄糖氧化酶蛋白。由于基因工程菌株分泌到基质中的其本身内源蛋白量很少，基质中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能简化后期的蛋白纯化操作。目前国外主要用基因克隆、表达来提高菌株的产酶活力，在这一领域研究已经比较深入。Whittington H成功地将青霉菌的GOD基因导入到酿酒酵母中，获得了具有生物活性的；Szynol实现了葡萄糖氧化酶基因在大肠杆菌中的表达8；Silvia Crognale将一株青霉的葡萄糖氧化酶基因成功导入到毕赤酵母中，发酵培养酶活达到50U/ml ;国内在这一方面的研究也取得了一定的进展。母敬郁等9采用瑞氏木霉表达了黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因，经过对重组后的瑞氏木霉进行诱变筛选，突变株的葡萄糖氧化酶发酵液酶活达到25U/ml 。目前已有多种外源基因表达系统被开发出来，如大肠杆菌表达系统、酵母表达系统等大肠杆菌表达系统虽然发展较为成熟，操作简单、周期短、产量高，但其表达产物无翻译后的修饰与加工过程，不能对蛋白质进行翻译，酵母繁殖速度快、易于培养、基因工程操作简便，并能够对目的蛋白进行翻译后加工与修饰，越来越广泛地用作外源基因表达的宿主菌株1。 虽然目前利用基因工程的手段实现了葡萄糖氧化酶的异源表达，但是由于表达量不高导致的生产成本高的问题仍然没有得到有效的解决，阻碍了葡萄糖氧化酶的大规模工业化生产及应用。因此如何采用基因工程技术实现葡萄糖氧化酶基因的高效表达，使葡萄糖氧化酶的产量得到大幅度的提高成为了亟待解决的关键问题。3. 葡萄糖氧化酶的应用葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性、高活性和催化高效性，对人体无毒副作用等优点被广泛地应用于食品工业、医药、饲料添加等方面。其最主要的用途是生产葡萄糖酸及作为抗氧化剂而广泛用于食品保鲜过程中。3.1 葡萄糖氧化酶在食品工业中的应用目前葡萄糖氧化酶在食品工业中主要应用在以下五个方面：脱氧、改良面粉、去葡萄糖、测定葡萄糖含量、杀菌。3.1.1 脱氧葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品常常出现变色、浑浊、沉淀等现象，影响了产品的品质究其原因是因为氧气氧化了其中的还原性物质如黄酮、亚油酸、亚麻酸等。GOD可快速高效地去除食品中的氧气，保护食品中还原性物质不被氧化破坏，达到脱氧保鲜的效果10。 在啤酒生产中，氧气的存在一方面会导致啤酒的色泽加深、氧化变质，同时氧气又为微生物的生长提供了便利条件，降低保存期，通过添加无毒副作用的葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯，葡萄糖酸内酯性质较稳定，没有酸味、无毒副作用，对啤酒的质量没有什么影响，而且不具有氧化能力。并且反应在消耗氧气的同时产生过氧化氢，过氧化氢本身就是一种杀菌剂，可以抑制微生物的生长，氧气的消耗减缓了啤酒的氧化变质过程，有效防止啤酒老化，明显降低啤酒浊度，改善啤酒的风味，延长啤酒的保质期。葡萄糖氧化酶的价格适宜,添加量少,每瓶啤酒只需加入10单位葡萄糖氧化酶,可使总氧从2.5mg/L降为0.05mg/L,去氧达98%,去氧效果之佳为其他同类产品所无法比拟。每瓶啤酒(640mL)成本才人民币0.003元。不需要增添任何设备,不需改变原生产工艺,使用方便,适合大生产使用。在酸奶和各种发酵乳的生产中，添加GOD消耗掉氧气，延缓产品氧化变质,乳酸菌采用厌氧发酵，GOD的加入不会影响功能性乳制品中的益生菌，同时能抑制好氧杂菌的生长，提升了乳制品的品质和风味11.在水果贮存中,GOD脱除氧气，水果的非酶褐变得到抑制，水果的品质及储存期都得到改善。3.1.2 改良面粉葡萄糖氧化酶是面粉改良剂与面包品质改良剂。传统的小麦粉强筋剂以溴酸钾的应用最为普遍，但经研究发现溴酸钾能够使动物组织致癌，不利于人体健康。目前，GOD作为面粉改良剂溴酸钾的替代品，已经用作一种更为安全的面粉改良剂12。改良面粉的原理是，GOD催化-D-葡萄糖生成过氧化氢，而面筋蛋白中的巯基(-SH)在过氧化氢的作用下被氧化形成二硫键(-S-S-) ，而二硫键的形成有助于面团的网络结构的形成；同时面粉中过氧化物酶作用于过氧化氢产生自由基，促进戊聚糖的氧化交联反应，有利于可溶性戊聚糖氧化凝胶形成较大的网状结构，增强了面团的弹性在这个过程中需要控制 GOD的添加量，否则多余的酶不利于强筋作用。GOD在面包焙烤中能够改善耐机械搅拌性、入炉急涨特性等影响面包品质的关键因素，使面团更加稳定，增大面包体积，增加弹性，改善面包的外形和口感。3.1.3 去葡萄糖食品加工工艺中部分糖蛋白分解后，还原糖的醛基和氨基酸的羧基会产生美拉德反应，使产品褐变，破坏产品品质，全球每年因为美拉德反应造成的食物浪费都很巨大。GOD能将葡萄糖分子上的醛基转变为羧基，消除美拉德反应，从而抑制食品的非酶褐变，保持产品的色泽和溶解性。将GOD添加到蛋白粉、果酱制品等糖含量较高的食品中，能除去葡萄糖，抑制产品加工过程中产生的褐变。同时由于葡萄糖含量降低，微生物生长受到抑制，产品的货架期得以延长12。3.1.4 葡萄糖的定量分析酶的专一性的特点，使得GOD可用于测定各种食品和混合物中葡萄糖含量。目前用固定化技术制成的GOD分析仪已用于测定发酵液的残糖量，该方法简单、快速、准确,真正起到了指导生产的作用。据此原理制成的葡萄糖测定试剂盒，可定量测定果汁、饮料及牛奶等多种食品中葡萄糖的含量。3.1.5 杀菌由于葡萄糖氧化酶的脱氧作用，消耗氧气，从而有效的抑制了好氧微生物的生长繁殖，同时产生的过氧化氢本身就是一种杀菌剂。在实际的生产应用中，常将过氧化氢酶与葡萄糖氧化酶组成酶系添加于食品中，这样既能利用过氧化氢的杀菌作用，同时由于过氧化氢酶的存在能去除残留在食品中的过氧化氢，不仅延长食品的保质期，对食品的品质也不会造成影响。GOD相比于其他化学抑菌剂的优势在于其作为生物制剂安全性更高，添加于食品中更加安全放心。3.2 葡萄糖氧化酶在吃饲料行业中的应用 葡萄糖氧化酶是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。由于葡萄糖氧化酶能催化肠道内的葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，当过氧化氢积累到一定浓度时，直接抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌的生长繁殖。其作用机理完全不同于抗生素，不会产生菌体抗药性或药物残留。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除肠道内氧气，为厌氧有益菌双歧杆菌的增殖制造厌氧环境。生成的葡萄糖酸可降低胃肠内pH值，为乳酸菌生长制造酸性环境。有益菌大量增殖形成微生态竞争优势，不利于大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的存活，控制感染，排除腐败物质，提高巨噬细胞活性，从而提高机体免疫力。葡萄糖氧化酶可以作为单一酶制剂，添加到动物的基础日粮中，也可与其它功能成分组成复合添加剂，如饲用动物肠道保护剂、饲用动物营养补充剂、饲料霉菌毒素脱除剂等。其作为一种新型绿色的饲料酶制剂，已被广泛应用于鸡用配合饲料、猪用配合饲料、牛羊配合饲料以及其他配合饲料，然而由于微生物发酵制备高产高活葡萄糖氧化酶还存在一定困难，从而制约了葡萄糖氧化酶在我国饲料工业中的规模化应用13。3.3葡萄糖氧化酶在医药行业中的应用 葡萄糖氧化酶和乳酸过氧化物酶（LPO）、淀粉葡糖苷酶、葡聚糖酶、溶菌酶等酶制剂可除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成。含有葡萄糖氧化酶的药物，其稳定性提高3倍。含有GOX、LPO和含碘化合物等成分的制剂，可用于口腔卫生除口臭，并具有抗头皮屑的作用。含GOX和LPO的双酶口香糖，在咀嚼时抑菌有效率达96%99%。GOX可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。作为试剂盒、酶电极等用于血清（浆）、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析4。4、葡萄糖氧化酶的发展前景 葡萄糖氧化酶是一种绿色、安全的酶制剂，在食品、医药、饲料等行业得到广泛应用。但目前规模化生产高活性的葡萄糖氧化酶还有困难。发酵生产葡萄糖氧化酶的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。国内葡萄糖氧化酶产量与国外报道的最高产量120 U/mL尚有差距，有待提高。酵母菌的基础研究较透彻，生长代谢速度快，是目前最有潜力的改造菌株，但基因工程构建菌株耗资大，菌株易退化，工业生产还有难度。 利用葡萄糖氧化酶延长食品的保质和保鲜期是非常有潜力的课题。葡萄糖氧化酶在动物体内的作用方式、最佳作用条件、代谢过程有待研究。如何更经济、更有效地制备和提纯葡萄糖氧化酶也是今后研究的方向。随着研究的不断深入，葡萄糖氧化酶的应用前景将会更加广阔。参考文献：1 朱运平，伍少明，李秀婷，等. 微生物葡萄糖氧化酶的生产及其在食品工业中应用的研究进展 J. 中国食品添加剂，2013（5）：165-172.2 刘超，袁建国，王元秀，等·葡萄糖氧化酶的研究进展J·食品与药品，2010,12（07）：2852893 何庆国，丁立孝主编·食品酶学·北京：化学工业出版社，20064 李艳，李静·葡萄糖氧化酶及其应用J·食品工程，2006（3）：9-11.5 朱运平，伍少明，李秀婷等. 微生物葡萄糖氧化酶的生产及其在食品工业中应用的研究进展 J 中国食品添加剂，2013（5）：165-172.6 Ray S, Bnaik A K. 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