限制性内切酶酶切位点保护碱基.doc
精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。DNA合成，新链的延伸方向是53因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（53）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 >90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 >90>90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 >90 >90 00 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 >90 75 750 >90 >90 >90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 >900 75 >90 >90DNA合成，新链的延伸方向是53因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（53）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列【精品文档】第 4 页
