生物化学实验基本技术解读ppt课件.ppt

生物化学实验基本技术生物化学实验基本技术 第一节第一节 生物大分子的基本制备技术生物大分子的基本制备技术一、盐析（一、盐析（Salting outSalting out）技术）技术定义定义：蛋白质在高浓度盐的溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，：蛋白质在高浓度盐的溶液中，随着盐浓度的逐渐增加， 由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉 淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同 浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。影响因素影响因素： 1.盐的种类盐的种类 2.2.盐的浓度盐的浓度 3.pH3.pH值值 4.4.温度温度 5.5.蛋白质浓度蛋白质浓度 二、透析和超滤二、透析和超滤 (Dialysis and Ultrafiltration)1.1.透析透析 是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜 而进行纯化的一种方法。而进行纯化的一种方法。 2.2.超滤超滤 是利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液是利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液 进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜 上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、 更换缓冲液或浓缩的目的。更换缓冲液或浓缩的目的。 第二节第二节 分光光度法分光光度法一、基本原理一、基本原理当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。定各种不同的物质。分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯度。其理论依据是郎伯比尔比尔(Lambert-Beer)(Lambert-Beer)定律。定律。 A=KCLA=KCL 二、分光光度计的结构原理二、分光光度计的结构原理三、几种常用的国产分光光度计三、几种常用的国产分光光度计（一）（一）721721型分光光度计型分光光度计（二）（二）UV-754UV-754型分光光度计型分光光度计 是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为分布在两相中，其中一相为固定相固定相，另一相流，另一相流过此相称作过此相称作流动相，流动相，并使各组分以不同速度移并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。第三节第三节 层析技术层析技术原理原理层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相 流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析 离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小常用的层析原理 1.分配层析分配层析纸层析纸层析 原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（个常数，即分配系数（）。）。 固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（酚）流动相：有机溶剂（酚） =纸层析 纸层析是最简单的液一液相分配层析。纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，定的温度条件下，R Rf f是个常数。是个常数。2 离子交换层析 原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。 常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）交联剂：二乙烯苯） 阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：NaNa+ +、H H+ + 阴离子：阴离子：ClCl- -、OHOH- -示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子示意图水分子B物质A物质3 吸附层析 原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。定时间然后才离开，此为吸附现象。 吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力基团之间的静电引力( (形成离子键形成离子键) )、氢键及范德华、氢键及范德华引力等。引力等。 在不同条件在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用可能几种力同时起作用 吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。聚酰胺；滑石、陶土、粘土。吸附层析示意图 吸附剂吸附剂易吸附分子易吸附分子不易吸附分子不易吸附分子4 亲和层析 原理：利用分子间具有专一亲和力而设计原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。的层析技术。 专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、原与抗体、DNADNA和和RNARNA、激素和其受体、激素和其受体 载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。5 凝胶过滤 原理：被分离物质因分子大小不同，在凝原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。胶中向下移动的速度不同。 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。 凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。第四节第四节 电泳技电泳技术术 一、定义一、定义： 在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下， 向相反电极方向移动的现象，称为电泳。向相反电极方向移动的现象，称为电泳。 淀 粉 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳琼 脂 糖 凝 胶 电 泳凝 胶 支 持 物 区 带 电 泳纸 电 泳醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 薄 层 电 泳非 凝 胶 支 持 物 电 泳用 支 持 物 区 带 电 泳显 微 电 泳等 电 聚 焦 电 泳等 速 电 泳不 用 支 持 物 电 泳是 否 用 支 持 物二、电泳技术分类二、电泳技术分类三、电泳技术基本原理1.1.基本原理基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。关。 pH pIpH pI 分子带负电荷分子带负电荷, ,在电场中向正极移动在电场中向正极移动; ; pH pIpH 蛋蛋 GlyGly m mclclclclmm蛋蛋蛋蛋m m GlyGly GlyGly 凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子， GlyGly为慢为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。离子，蛋白质样品被夹在中间。 缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图 快离子 慢离子 蛋白质样品 E：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/( (电导电导率率) ) E E与电泳速度成正比与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。被进一步浓缩。电位梯度的不连续性 E：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/( (电导电导率率) ) E E与电泳速度成正比与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。被进一步浓缩。电位梯度的不连续性四个不连续性造成样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括原理包括： 缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性 电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括： 凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应( (缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括： 凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应( (缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括： 凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应( (缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括： 凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应( (缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3) 蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶B.电荷效应 蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离解离度增大，不存在快、慢离子度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电之分，蛋白质样品在均一电场强度和场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。 由于各种蛋白质由于各种蛋白质pIpI不同，所不同，所载有效电荷不同，因此质点载有效电荷不同，因此质点的的 有效迁移率不同，形成不有效迁移率不同，形成不同区带。同区带。 缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶C.分子筛效应 分离胶的孔径小，各分分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出所受阻力不同，表现出不同的不同的 泳动速度，即分泳动速度，即分子筛作用。分子量小，子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度形状为球形的泳动速度最快。最快。 缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第五节第五节 离心技术离心技术一、基本原理一、基本原理 物体围绕中心轴旋转时会受到离心力物体围绕中心轴旋转时会受到离心力F F的作用。当物体的的作用。当物体的质量为质量为 M M、体积为、体积为V V、密度为、密度为D D、旋转半径为、旋转半径为r r、角速度为、角速度为（弧度数（弧度数/ /秒）时，可得：秒）时，可得： F=MF=M2 2r r或者或者 F=V.D.F=V.D.2 2r r 二、离心技术的应用二、离心技术的应用 1.1.沉降速度离心沉降速度离心 是指在离心管内液体密度均一情况下进行的离心。是指在离心管内液体密度均一情况下进行的离心。 2.2.梯度离心梯度离心 是待分离的物质在具有密度梯度的介质中进行的离心。是待分离的物质在具有密度梯度的介质中进行的离心。梯度离心可分为两种梯度离心可分为两种，即密度梯度离心（又称沉降速度离心、速度，即密度梯度离心（又称沉降速度离心、速度区带离心或差速区带离心）和平衡密度梯度离心（等密度梯度离心区带离心或差速区带离心）和平衡密度梯度离心（等密度梯度离心和沉降平衡离心）。和沉降平衡离心）。