第十一章：外源基因表达与基因工程药物ppt课件.ppt

我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物药学分子生物学药学分子生物学张张 徐徐江苏大学江苏大学 医学院医学院 分子生物学及检验教研室分子生物学及检验教研室我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物RNA干扰干扰（RNA interference, RNAi） 在生物体细胞内，双链在生物体细胞内，双链RNA诱导同源诱导同源mRNA特特异性降解，导致基因表达抑制异性降解，导致基因表达抑制，又称又称转录后基因转录后基因沉默沉默 。RNARNA干扰作用机制：干扰作用机制：（1）siRNA形成：形成： dsRNA被被Dicer酶剪切成酶剪切成siRNA （2）RISC (RNA-induced silencing complex)形成形成（3）RISC 活化活化：siRNA解旋成为单链，无活性的解旋成为单链，无活性的RISC转变成活性形式转变成活性形式 (包含包含siRNA反义链反义链)（4）诱导靶诱导靶mRNA降解降解：在在siRNA反义链引导下反义链引导下，RISC识别并切割与识别并切割与siRNA反义链互补的靶反义链互补的靶mRNA；（5）dsRNA的再生成的再生成我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物siRNA （小干扰（小干扰RNA）：）：21-23nt，由长，由长dsRNA裂解而成的小片段，可诱导裂解而成的小片段，可诱导mRNA降解。降解。siRNA主要参与抵御外源主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。性病毒核酸的侵染。 细胞中存在两种细胞中存在两种RNA干扰现象：干扰现象：miRNA（微小（微小RNA）：）：由由miRNA前体剪前体剪切而成，可抑制切而成，可抑制mRNA翻译。翻译。 miRNA主主要参与内源性基因的表达调节。要参与内源性基因的表达调节。RNA干扰干扰（RNA interference, RNAi）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物siRNA (小干扰小干扰RNA) miRNA (微小微小RNA)来源来源siRNA是外源性的，是外源性的，是是RNA干扰的中间产物干扰的中间产物miRNA是内源的是内源的是生物体固有是生物体固有结构结构siRNA是双链是双链RNAmiRNA是单链是单链RNADicer酶酶加工过程加工过程对称地来源于双链对称地来源于双链RNA不对称加工，仅剪切不对称加工，仅剪切miRNA的侧臂的侧臂作用位置作用位置siRNA可作用于可作用于mRNA的的任何部位任何部位miRNA主要作用于靶标基主要作用于靶标基因因 3端非翻译区（端非翻译区（3-UTR）作用方式作用方式siRNA一般导致靶一般导致靶mRNA的降解，即为转录水平后的降解，即为转录水平后调控。调控。miRNA可抑制靶可抑制靶mRNA的的翻译，也可以导致靶翻译，也可以导致靶mRNA降解，即在转录后水平和翻降解，即在转录后水平和翻译水平起作用译水平起作用作用阶段作用阶段siRNA不参与生物生长，不参与生物生长，主要作用是抑制病毒感染主要作用是抑制病毒感染miRNA主要在发育过程中主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达起作用，调节内源基因表达我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物RNA干扰技术的应用干扰技术的应用q基因治疗基因治疗（基因失活性治疗）（基因失活性治疗）（1）病毒感染性疾病）病毒感染性疾病 通过通过RNAi抑制抑制RNA病毒复制病毒复制q基因功能研究基因功能研究（功能失活策略功能失活策略） （2）基因过表达引起的疾病）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）（如肿瘤） siRNA药物药物RNA干扰技术的实施策略干扰技术的实施策略体外合成体外合成siRNA、体内转录、体内转录shRNA 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因打靶基因打靶(gene targeting) 利用利用同源重组原理同源重组原理对细胞特定对细胞特定内源基因内源基因进行改造的技术。进行改造的技术。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因敲除（基因敲除（gene knockout）：）：宿主基因组宿主基因组中特定中特定功能基因功能基因的部分片段被的部分片段被同源的外源同源的外源DNA片段替代片段替代，从而使，从而使靶基因失活靶基因失活。基因敲入（基因敲入（gene knockin）：）：外源功能基因外源功能基因与宿主与宿主基因组中的同源序列基因组中的同源序列进行同源重组，进行同源重组，插入到基因组中，从而在细胞内获得表达。插入到基因组中，从而在细胞内获得表达。基因打靶基因打靶（gene targeting）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因敲除小鼠的产生基因敲除小鼠的产生1. 体外构建体外构建基因敲除载体基因敲除载体：靶靶基因同源基因同源DNA序列序列+选择性选择性标记基因标记基因2. 将基因敲除载体导入将基因敲除载体导入ES细胞细胞：显微注射法、电穿孔法等显微注射法、电穿孔法等3. 筛选、鉴定发生了同源重组筛选、鉴定发生了同源重组的的ES细胞：细胞：标记筛选法、分标记筛选法、分子鉴定法子鉴定法4. 将将ES细胞导入细胞导入胚胎胚胎，胚胎植，胚胎植入假孕雌鼠的子宫入假孕雌鼠的子宫5. 小鼠交配传代获得小鼠交配传代获得特定的纯特定的纯合基因型子代小鼠合基因型子代小鼠我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出现明显体重增加现象出现明显体重增加现象我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物REG基因敲除鼠（下图）出现脊椎弯曲等早衰现象基因敲除鼠（下图）出现脊椎弯曲等早衰现象我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Gab1Gab1基因敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺基因敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。的信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 酪氨酸酶酪氨酸酶基因敲除后，本来是黑色的小猪，基因敲除后，本来是黑色的小猪，变成了白色，表现出典型的白化病特征。变成了白色，表现出典型的白化病特征。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因编辑基因编辑（gene editing） 对目标基因进行对目标基因进行“编辑编辑”，实现对特，实现对特定定DNA片段的敲除、加入等。片段的敲除、加入等。 CRISPR/Cas系统系统：由：由CRISPR基因座基因座与其串联的与其串联的Cas基因组成，通过序列特异基因组成，通过序列特异的的RNA介导，切割降解介导，切割降解DNA。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9CRISPRCRISPR：成簇规律间隔性短回文重复序列：成簇规律间隔性短回文重复序列CasCas：CRISPRCRISPR相关基因相关基因我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物RNA干扰（干扰（RNAi)siRNA、miRNARNA干扰技术策略、应用干扰技术策略、应用基因敲除基因敲除基因编辑基因编辑常用分子生物学技术：常用分子生物学技术：RNA干扰、基因敲除干扰、基因敲除小结小结我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物作作 业业 比较比较RNA干扰干扰与与基因敲除基因敲除的异同点，简述它们在药学的异同点，简述它们在药学中的应用。中的应用。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第十章第十章 外源基因表达与外源基因表达与 基因工程药物基因工程药物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因工程药物基因工程药物重组人胰岛素重组人胰岛素重组人白细胞介素重组人白细胞介素-2-2重组人干扰素重组人干扰素我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物外源基因表达：外源基因表达：利用分子生物学技利用分子生物学技术，在体外将外源基因重组至合适术，在体外将外源基因重组至合适表达载体上，通过有关技术将其导表达载体上，通过有关技术将其导入宿主细胞，借助宿主细胞内系统，入宿主细胞，借助宿主细胞内系统，合成具有生物活性的蛋白质。合成具有生物活性的蛋白质。基因工程技术：基因工程技术：基因克隆基因克隆（上游（上游技术）技术）+ +外源基因表达外源基因表达（下游技术）（下游技术）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基 因 克 隆 上世纪上世纪7070年代发展起来的一种分年代发展起来的一种分子生物学技术，也称分子克隆。子生物学技术，也称分子克隆。 通过相应技术手段，将目的基因通过相应技术手段，将目的基因导入宿主细胞，并在宿主细胞内大导入宿主细胞，并在宿主细胞内大量复制。按步骤可概括为量复制。按步骤可概括为分、切分、切、连、转、筛。、连、转、筛。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物切连转筛获取目的基因和载体目的基因和载体连接重组DNA导入受体细胞重组体的筛选与鉴定基 因 克 隆我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 一、目的一、目的DNADNA的的分分离获取（分）离获取（分）二、载体的选择与限制酶二、载体的选择与限制酶切切（切）（切）三、目的三、目的DNADNA与载体与载体连连接（接（连连）四、重组四、重组DNADNA转转入受体细胞（转）入受体细胞（转）五、重组体的五、重组体的筛筛选与鉴定（筛）选与鉴定（筛）基因克隆五个基本部分基因克隆五个基本部分我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（一）目的基因的获得（一）目的基因的获得1、化学合成、化学合成 适用于合成适用于合成分子量较小的目的基因分子量较小的目的基因 2、PCR及及RT-PCR合成合成序列已知的基因序列已知的基因3、基因组文库与、基因组文库与cDNA文库文库包含包含全面的基因和全面的基因和mRNA信息信息我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物适用于合成适用于合成分子量较小的目的基因分子量较小的目的基因 （100bp以以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。 根据已知某种根据已知某种基因的核苷酸基因的核苷酸序列序列或某种或某种基因产物的氨基酸基因产物的氨基酸序列序列，可推导出为该多肽编码，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用的核苷酸短序列，再用DNA合合成仪人工合成目的基因。成仪人工合成目的基因。1、化学合成、化学合成DNA片段片段我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2、PCR与与RT-PCR 扩增扩增DNA模板模板上游引物上游引物下游引物下游引物PCR 扩增扩增目的片段目的片段mRNA逆转录逆转录cDNA上游引物上游引物下游引物下游引物PCR 扩增扩增目的片段目的片段我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基基因因组组文文库库3、基因组文库与、基因组文库与cDNA文库文库我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物cDNA文文库库3、基因组文库与、基因组文库与cDNA文库文库我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因组文库基因组文库（genomic library，G-文库）文库）是指含有某种生物是指含有某种生物全部基因随机片段全部基因随机片段的重组的重组DNA克隆群。克隆群。 cDNA文库文库（cDNA library，C-文库）文库） 以细胞以细胞全部全部mRNA经逆转录，制备出全经逆转录，制备出全套的套的cDNA克隆集合。克隆集合。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物如何从文库中获取目的基因？如何从文库中获取目的基因？文库查询（文库查询（screeningscreening）：）：采用探针与文库中的重组采用探针与文库中的重组DNADNA进行杂交反进行杂交反应应我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因组文库基因组文库特点：特点： p 含有基因组内全部基因片段（含有基因组内全部基因片段（99），是一个），是一个贮存基因组贮存基因组全部序列的信息库全部序列的信息库（含内含子等）；（含内含子等）；p 真核细胞真核细胞G-文库中含有较多的重复序列与内含文库中含有较多的重复序列与内含子，一个单拷贝基因只占基因组的子，一个单拷贝基因只占基因组的10-710-5 ； p 具有种属特异性，但无具有种属特异性，但无组织特异性组织特异性； 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 cDNA文库文库特点：特点： p cDNA文库中，平均一个目的基因所对应的文库中，平均一个目的基因所对应的mRNA占总占总mRNA的的10-410-3，相比之下后者比，相比之下后者比前者在含量上提高前者在含量上提高23个数量级，个数量级，便于提取目便于提取目的基因的基因。p 体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。p 既有种属特异性，又有组织特异性；既有种属特异性，又有组织特异性；我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物载体（载体（vector）：）：携带外源携带外源DNA进入宿主细胞进进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。行扩增或表达的工具。 2. 2. 按功能按功能克隆载体克隆载体表达载体表达载体1. 1. 按来源按来源质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒人工染色体人工染色体（二）目的基因与表达载体的重组（二）目的基因与表达载体的重组病毒病毒 (virus)质粒质粒 (plasmid)噬菌体噬菌体 (phage)我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物载体按功能分类载体按功能分类:克隆载体（克隆载体（cloning vector）表达载体表达载体（expression vector） 克隆载体基本组成：克隆载体基本组成： 复制原点复制原点； 限制酶切位点限制酶切位点； 带有筛选标记带有筛选标记；表达载体还具有：表达载体还具有： 表达调控元件表达调控元件我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物多克隆位点多克隆位点（multiple cloning sites, MCS）：）：一段人一段人工合成的工合成的DNA序列，含有密集排列的多种序列，含有密集排列的多种限制性内切限制性内切酶识别序列酶识别序列，以便不同来源的外源，以便不同来源的外源DNA片段插入载体。片段插入载体。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) 识别识别双链双链DNA分子分子中中特异核苷酸序列特异核苷酸序列的一类的一类核酸内切酶核酸内切酶，为原核生物所特有。为原核生物所特有。 分类分类：、类类基因工程技术中常用的是基因工程技术中常用的是类类 （分子剪刀）（分子剪刀），识别与切割位点序列特异，在识别序列内切割识别与切割位点序列特异，在识别序列内切割DNA重组重组 工具酶工具酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现的发现1970年，年，第一个限制性核酸内切酶第一个限制性核酸内切酶剪切剪切DNA操作操作DNA1978年，年，获诺贝尔生理学或医学奖获诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物类酶识别序列（类酶识别序列（46个碱基对）：个碱基对）： 回文结构回文结构 (palindrome)断裂磷酸二酯键，形成平端或粘端切口断裂磷酸二酯键，形成平端或粘端切口我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物平末端端或粘性末端平末端端或粘性末端（Cohesive/Sticky end）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. DNA连接酶连接酶一种封闭一种封闭DNA链上缺口的酶，催化链上缺口的酶，催化DNA链相邻的链相邻的3羟基与羟基与5磷酸基团形成磷酸基团形成磷酸二酯键磷酸二酯键。基因工程基因工程 “缝纫针缝纫针”我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因重组基因重组(gene recombination) 目的基因与载体分别经目的基因与载体分别经DNA限限制性核酸内切酶切割，再通过制性核酸内切酶切割，再通过DNA连接酶，将目的基因与载体连接酶，将目的基因与载体以以3,5-磷酸二酯键连接形成重组磷酸二酯键连接形成重组子（重组基因），也称子（重组基因），也称DNA重组。重组。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物DNA重组重组1972年，年，世界上第一个重组世界上第一个重组DNA分子诞生分子诞生Paul Berg猿猴病毒猿猴病毒DNA 噬菌体噬菌体DNA限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶 重组重组DNA分子分子1980年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物DNA重组重组策略策略同一种限制酶同一种限制酶酶切酶切 (一一) 粘性末端连接粘性末端连接缺点：缺点：载体自身环化；载体自身环化；连接方向错误；连接方向错误；我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase，ALPALP） 催化催化去除去除DNA、RNA或或dNTP上的上的 5 -磷酸基团磷酸基团。主要用途有：主要用途有： 防止防止载体载体DNA自身环化，提高重组效率自身环化，提高重组效率。5 - pCpGpC -OH 3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 - CpGpC -OH 3 5 -p3 -HO5 -HO3 -HO我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物碱性磷酸酶碱性磷酸酶: :防止载体的自身环化防止载体的自身环化 3 3 HO-G CTTAA-HO-G CTTAA-p p 5 5 5 5 p p-AATTC G-OH-AATTC G-OH 3 3 3 3 HO-G HO-G CTTAA-p 5 CTTAA-p 5 5 5 p-AATTCp-AATTC G-OH 3G-OH 3 质粒质粒 目的基因目的基因 目的基因目的基因和载体连接和载体连接 EcoREcoR EcoREcoR 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 3 3 HO-G CTTAA-HO-G CTTAA-OHOH 5 5 5 5 HOHO -AATTC G-OH -AATTC G-OH 3 3 退火退火 DNADNA连接酶连接酶 3 3 HO-G CTTAA HO-G CTTAA G G CTTAA-p 5 CTTAA-p 5 5 5 OHOH AATTC G AATTC G AATTC AATTC G-OH 3G-OH 3 识别识别G GAATTCAATTC序列序列 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（二）定向克隆（二）定向克隆使目的基因按正确方向插入载体中的方法。使目的基因按正确方向插入载体中的方法。 定向克隆的两种连接方式：定向克隆的两种连接方式：粘粘粘粘 连接连接粘平粘平 连接连接我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物本法适用于在本法适用于在载体和目的基载体和目的基因上因上没有相同没有相同的限制酶切位点的限制酶切位点（三）人工接头（三）人工接头(linker)(linker)化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段。化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段。 可在可在PCRPCR扩增目的基因时人为扩增目的基因时人为添加含有限制酶切位点的序添加含有限制酶切位点的序列到引物的列到引物的55末端末端我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（四）同聚物加尾连接（四）同聚物加尾连接 本法适用于在本法适用于在载体和目的基载体和目的基因上因上没有相同没有相同的限制的限制酶切位点酶切位点我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（五）（五） PCRPCR引入粘性末端后连接引入粘性末端后连接 PCR扩增扩增限制性酶切限制性酶切引物引物1引物引物2限制性酶切限制性酶切作用位点作用位点1限制性酶切限制性酶切作用位点作用位点2与经相应的限制性酶切的载体连接与经相应的限制性酶切的载体连接 在在PCRPCR扩增目的基因时将扩增目的基因时将限制性酶切位点限制性酶切位点人人为添加到引物的为添加到引物的55末端。经末端。经PCRPCR扩增获得扩增获得带有限带有限制性酶切位点的目的片段制性酶切位点的目的片段，用相应限制性酶切割，用相应限制性酶切割后，产生粘性末端，随后与载体（也经相应的限后，产生粘性末端，随后与载体（也经相应的限制性酶切割）进行粘性末端连接。制性酶切割）进行粘性末端连接。