2.3 分解纤维素的微生物的分离（20张PPT）.pptx
纤维素是一种广泛存在于植物（细胞壁）中的多糖，分子式为(C6H10O5)n，不能给动物直接利用吸收。,课题3分解纤维素的微生物的分离,华师附中汕尾学校杨宇涛,一、基础知识,（一）纤维素与纤维素酶1纤维素（1）化学组成：纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。（2）分布作用：植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。是植物细胞壁的主要结构成分。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。（3）与动物的联系：人体不能消化纤维素。草食动物则依赖其消化道中的微生物将纤维素分解，从而得以吸收利用。（4）商品纤维素：水溶性的羧甲基纤维素钠(CMCNa)、不溶于水的微晶纤维素(Avicel),糖苷键,一、基础知识,（一）纤维素与纤维素酶2.纤维素酶（1）组成：纤维素酶是一种复合酶（蛋白质），一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。（2）作用：C1酶和CX酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。（3）纤维素酶一般在微生物细胞内合成，在细胞外分解纤维素。,一、基础知识,（一）纤维素与纤维素酶2.纤维素酶（4）纤维素酶分解纤维素的实验：滤纸崩溃法,取二支20mL的试管,各加入一张滤纸条(富含纤维素),各加入pH4.8，物质的量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h(人工振荡),结果：乙试管的滤纸条消失,本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操控方法是：在乙试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在甲试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,一、基础知识,（二）纤维素分解菌的筛选1.方法：刚果红染色法2.原理：刚果红（简称CR）是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,例：下列关于纤维素酶的说法，错误的是（）A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,D,例：利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是（）A、刚果红能与纤维素形成红色复合物B、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,B,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,旁栏思考1本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的稀释菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本相同。,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。人工设置环境，将滤纸埋在10的土壤中，约30d，再从已经腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物（浓缩目的菌）。制备选择培养基,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物（浓缩目的菌）。制备选择培养基具体操作：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,提高培养液中溶解氧的含量使菌体和培养液充分接触，提高营养物质的利用率,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,制备鉴别培养基,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,制备鉴别培养基涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养。刚果红染色法,1mg/mL刚果红(CR)溶液,.,.,.,.,1mol/LNaCl溶液,10-15min后倒去CR溶液,漂洗作用。CR能与纤维素形成红色复合物,但分解纤维素的细菌可产纤维素酶,能将纤维素分解,这样刚果红就不能结合上去。氯化钠就可使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大小不一的透明圈。,15min后倒去NaCl溶液,透明圈,方法一,鉴别培养基+刚果红溶液(灭菌),倒平板,菌液涂布,倒置培养,黑点表示”菌体”,透明圈,方法二,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,制备鉴别培养基涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养。刚果红染色法,二、实验设计,土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落,挑选产生透明圈的菌落，根据透明圈的大小判断纤维素酶活力的大小用接种针挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基，在30左右恒温箱内培养，即实现了菌株的纯化培养。,三、课题延伸,（一）为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。（二）纤维素酶测定方法：对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖进行定量测定,
