RNA的结构和功能ppt课件.pptx

二、病毒和细菌基因组的特点二、病毒和细菌基因组的特点1、共同点、共同点u 基因组较小，只有一个环形或线性的基因组较小，只有一个环形或线性的DNA分子分子u 多数序列用来编码蛋白质，基因间的间隔序列很短多数序列用来编码蛋白质，基因间的间隔序列很短u 功能相关的基因常串联在一起，由共同的调控元件功能相关的基因常串联在一起，由共同的调控元件调控，并转录成同一调控，并转录成同一mRNA分子，指导蛋白质合成，称分子，指导蛋白质合成，称为为操纵子操纵子。2. 2. 病毒基因组的特点病毒基因组的特点 1）病毒基因组可以由）病毒基因组可以由DNA或或RNA组成，组成，但每种病毒只但每种病毒只含一种核酸（单、双链，环形、线性）。含一种核酸（单、双链，环形、线性）。2）根据合成蛋白质的方式分类：）根据合成蛋白质的方式分类：正链病毒正链病毒：RNA进入宿主细胞后，进入宿主细胞后， 直接指导蛋白质的合成直接指导蛋白质的合成负链病毒：负链病毒：RNA进入宿主细胞后，先合成与其碱基序列互补的进入宿主细胞后，先合成与其碱基序列互补的RNA, 再指导蛋白质合成再指导蛋白质合成双链病毒：双链病毒：RNA为双链，在宿主细胞中先以负链为模板合成正为双链，在宿主细胞中先以负链为模板合成正链链RNA来指导蛋白质合成，随后合成负链来指导蛋白质合成，随后合成负链RNA, 构成双链构成双链RNA，并和蛋白质组装成新的病毒并和蛋白质组装成新的病毒逆转录病毒：逆转录病毒：RNA进入宿主后，在逆转录酶作用下，合成与其进入宿主后，在逆转录酶作用下，合成与其互补的互补的DNA（cDNA), cDNA转录生成转录生成mRNA指导蛋白质合成。指导蛋白质合成。3）重叠基因）重叠基因u 一段可以编码多个肽链的核酸序列一段可以编码多个肽链的核酸序列u 重叠基因普遍存在，超过基因总量的重叠基因普遍存在，超过基因总量的10%3. 细菌基因组的特点细菌基因组的特点u 细菌染色体有一环形或线性细菌染色体有一环形或线性DNA分子，只有分子，只有一个复制起点一个复制起点u 编码蛋白质的基因是单拷贝的，但编码蛋白质的基因是单拷贝的，但rRNA基基因是多拷贝的因是多拷贝的u 基因组有多种调控区和少量重复序列基因组有多种调控区和少量重复序列u 基因组中存在可移动的基因组中存在可移动的DNA序列（转座子）序列（转座子）三、真核生物基因组特点三、真核生物基因组特点1. 基因组较大基因组较大 核基因由多条线性染色体构成，每条染色体含有一核基因由多条线性染色体构成，每条染色体含有一线性线性DNA分子，分子，DNA分子含有多个复制起点。分子含有多个复制起点。2.不存在操作子不存在操作子 功能相关的基因组成基因簇，基因是在多种调控功能相关的基因组成基因簇，基因是在多种调控因子的作用下协调表达。因子的作用下协调表达。3. 存在大量的重复序列存在大量的重复序列 u高度重复序列高度重复序列u中度重复序列中度重复序列u低度重复序列低度重复序列u单一序列（非重复序列）单一序列（非重复序列）4. 有断裂基因有断裂基因u大多数为蛋白质编码的基因都含有不编码的大多数为蛋白质编码的基因都含有不编码的内含内含子子和编码的和编码的外显子外显子。u内含子将基因分割成断裂基因（不连续基因）内含子将基因分割成断裂基因（不连续基因）u真核生物的基因组含有大量重复序列和内含子，真核生物的基因组含有大量重复序列和内含子，外显子所占比例较小。（人类：外显子所占比例较小。（人类：1.5%）第六节第六节 RNA的结构与功能的结构与功能1. 碱基组成碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀稀有碱基较多，稳定性较差，易水解有碱基较多，稳定性较差，易水解2. 多为单链结构多为单链结构; 少数局部自身回折形成双螺少数局部自身回折形成双螺旋（旋（40%70%), 不能配对的碱基形成突环不能配对的碱基形成突环3. 分子较小分子较小组成特点组成特点1.RNA通常是单链线形分子通常是单链线形分子(一级结构一级结构)2. 自身回折形成局部双螺旋自身回折形成局部双螺旋(二级结构二级结构)3. 进而折叠（进而折叠（三级结构三级结构）4.多数形成核蛋白复合物（多数形成核蛋白复合物（四级结构四级结构） 如：核糖体、拼接体、编辑体等如：核糖体、拼接体、编辑体等。 结构特点结构特点核糖核苷酸通过核糖核苷酸通过 3，5，-磷酸二酯键相磷酸二酯键相连形成长链连形成长链RNA的种类、分布、功能的种类、分布、功能除了上述三种除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子他种类的小分子RNA，统称为，统称为非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 核糖体核糖体RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL - RNA 核糖体组分核糖体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基酸成熟成熟mRNA的前体的前体参与参与 hnRNA 的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分RNA信使信使RNARNA转运转运RNARNARNA核内小核内小胞浆小胞浆小RNARNA细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL - RNA 蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基酸的前体的前体的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNARNA含量含量80510-15 一、转运一、转运RNA的结构与功能的结构与功能tRNA占细胞占细胞RNA总量的总量的15%，在细胞，在细胞核内形成，核内形成，分子量最小；分子量最小； tRNA在细胞质中将氨基酸转运到核糖在细胞质中将氨基酸转运到核糖体体-mRNA中，指导蛋白质合成；中，指导蛋白质合成； 细胞内有细胞内有50种以上的种以上的tRNA； tRNA分子较小，沉降系数平均为分子较小，沉降系数平均为4S。由由7090个核苷酸组成个核苷酸组成含含 1020% 稀有碱基稀有碱基 3 末端为末端为 CCA-OH 5 末端大多数为末端大多数为G具有具有 T C （一）（一）tRNA的一级结构特点的一级结构特点 稀有碱基稀有碱基 HNNHOOR51HNNNNHNCH2CH2NOO7ORIRDHUNNNNOHRmGH2NCH3 （二）（二）tRNA的二级结构的二级结构三叶草型模型三叶草型模型1 12 23 3反密码子环反密码子环 反密码子反密码子D环环TC环环可变环可变环四四环环四四臂臂D臂臂氨基酸臂氨基酸臂反密码子臂反密码子臂TC臂臂氨基酸臂：氨基酸臂：由由7对对bp组成，富含组成，富含G， 末端为末端为CCA，接受活化，接受活化AA二氢尿嘧啶环（二氢尿嘧啶环（D环）环） 由由814个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶核苷（个核苷酸组成，含有二氢尿嘧啶核苷（D），），与氨基酰与氨基酰tRNA合成酶的结合有关合成酶的结合有关反密码环：反密码环：识别识别mRNA上的密码子上的密码子可变环：可变环：大小是大小是tRNA分类的重要指标分类的重要指标假尿嘧啶核苷假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷环（胸腺嘧啶核苷环（T C环）：环）： 含有保守的含有保守的T C顺序，可识别核蛋白体上的顺序，可识别核蛋白体上的rRNA, 促使促使tRNA与核蛋白体结合与核蛋白体结合（三）（三） tRNA的三级结构的三级结构 倒倒L形形D臂臂反密码臂反密码臂氨基酸臂氨基酸臂T C臂臂 tRNA三级结构像倒写的字母三级结构像倒写的字母“L” 氨基酸臂和氨基酸臂和T C臂同轴排列，形成臂同轴排列，形成12bp的连续的连续双螺旋双螺旋 反密码子臂和反密码子臂和D臂同轴排列，跟氨基臂所在轴垂直臂同轴排列，跟氨基臂所在轴垂直 D环和环和T C环组成倒环组成倒L的转角，两环间的的转角，两环间的氢键和氢键和碱基堆积力碱基堆积力稳定了转角构象稳定了转角构象 D环，环， T C环和可变环中核苷酸残基形成了特定环和可变环中核苷酸残基形成了特定的碱基对，稳定了的碱基对，稳定了tRNA的三级结构的三级结构tRNA三级结构特点三级结构特点 tRNA的功能：的功能：u 结合活化氨基酸（结合活化氨基酸（ 3 -CCA-OH ），搬运氨基），搬运氨基酸到核糖体酸到核糖体u 识别识别mRNA密码子。密码子。u 参与蛋白质的翻译。参与蛋白质的翻译。rRNA的特点的特点u rRNA占细胞占细胞RNA总量的总量的80%，分子量最大分子量最大u 核糖体由核糖体由40%的蛋白质和的蛋白质和60%的的rRNA组成组成u rRNA自身的构象决定了核糖体亚基的形态自身的构象决定了核糖体亚基的形态u 催化肽键合成的是催化肽键合成的是rRNA u 蛋白质维持蛋白质维持rRNA构象，起辅助作用构象，起辅助作用二、核蛋白体二、核蛋白体RNA的结构与功能的结构与功能rRNA的功能的功能 参与组成核蛋白体，参与组成核蛋白体，催化肽键的形成催化肽键的形成。rRNA的种类（根据沉降系数）的种类（根据沉降系数）真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA复杂的多环多臂结构复杂的多环多臂结构大肠杆菌大肠杆菌16s rRNA核蛋白体的组成核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸个核苷酸18S1874个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质21种种占总重量的占总重量的40%33种种占总重量的占总重量的50%大亚基大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质31种种占总重量的占总重量的30%49种种占总重量的占总重量的35%三、信使三、信使RNA的结构与功能的结构与功能结构特点：结构特点：1. mRNA占细胞总占细胞总RNA的的3%-5%，含量最少含量最少2. mRNA编码区的核苷酸序列决定蛋白质的氨基酸编码区的核苷酸序列决定蛋白质的氨基酸序列序列3. mRNA分子中含有非编码区分子中含有非编码区4. 大多数真核大多数真核mRNA的的5 末端均在转录后加上一个末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C 2也是甲基也是甲基化，形成化，形成帽子结构帽子结构：m7GpppNm-。 mRNA的帽子结构可保护的帽子结构可保护mRNA免受核酸酶从免受核酸酶从5端的降解，并在翻译起始中起重要作用。端的降解，并在翻译起始中起重要作用。5. 大多数真核大多数真核mRNA的的3 末端有末端有200多个腺苷酸多个腺苷酸残基残基的结构，称为的结构，称为多聚多聚A尾尾。其作用在于增加其作用在于增加mRNA的稳定性和维持其翻译活动。的稳定性和维持其翻译活动。5 末端帽子结构：末端帽子结构：m7GpppN3 末端有多聚腺苷酸尾巴结构末端有多聚腺苷酸尾巴结构(polyA) 单顺反子（一条单顺反子（一条mRNA链上有一个编码区）链上有一个编码区）真核生物、原核生物真核生物、原核生物mRNA一级结构特点一级结构特点（1）真核细胞）真核细胞mRNA真核生物真核生物mRNA的共价结构的共价结构原核生物原核生物mRNA为多顺反子，无修饰碱基。为多顺反子，无修饰碱基。（多顺反子（多顺反子mRNA：一条：一条mRNA链上有多个编码区）链上有多个编码区）（2）原核细胞）原核细胞mRNA原核生物原核生物mRNA的的转录和翻译同时进行转录和翻译同时进行，不需剪，不需剪接和加工，直接指导蛋白质合成接和加工，直接指导蛋白质合成真核生物先在核内合成包含内含子和外显子的真核生物先在核内合成包含内含子和外显子的mRNA前体前体，形成分子大小不均一的核内不均一，形成分子大小不均一的核内不均一RNA(hnRNA)。hnRNA通过剪接和加工，转化为成熟的通过剪接和加工，转化为成熟的mRNA, 进进入细胞质，指导蛋白质合成。入细胞质，指导蛋白质合成。真核生物、原核生物真核生物、原核生物mRNA成熟过程的特点成熟过程的特点hnRNA 内含子内含子( (intron) )mRNA 真核生物真核生物mRNA成熟过程成熟过程 外显外显子子( (exon) )DNAmRNA蛋白蛋白转录转录翻译翻译细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接转录后剪接转运转运mRNAhnRNA翻译翻译蛋白蛋白真核生物真核生物原核生物原核生物mRNA的功能的功能 把把DNA所携带的遗传信息，按碱所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。排列顺序。四、四、snRNA和和snoRNA核小核小RNA（ snRNA）含量及分布）含量及分布 主要存在于细胞核中，含量占总主要存在于细胞核中，含量占总RNA量的量的0.1%1%。snRNA存在形式及作用存在形式及作用usnRNA均与蛋白质相连，以核糖核蛋白的形式存在。均与蛋白质相连，以核糖核蛋白的形式存在。u在在hnRNA的剪接、细胞分裂和分化、细胞内物质运输及的剪接、细胞分裂和分化、细胞内物质运输及构成染色体等方面起作用。构成染色体等方面起作用。核仁小核仁小RNA（snoRNA)：u 位于核仁，几十位于核仁，几十几百个碱基。几百个碱基。u snoRNA参与参与rRNA前体的加工以及部分核苷酸的前体的加工以及部分核苷酸的甲基化修饰。甲基化修饰。五、反义五、反义RNA和和RNA干扰干扰反义反义RNA（asRNA)的特性的特性u asRNA在翻译水平上抑制基因表达，还可抑在翻译水平上抑制基因表达，还可抑制制DNA复制和转录。复制和转录。u asRNA稳定性较差。稳定性较差。RNA干扰（干扰（RNAi) 利用双链利用双链RNA抑制特定基因表达的技术。抑制特定基因表达的技术。（应用一段与（应用一段与asRNA序列互补的序列互补的RNA，两者构成，两者构成双链，稳定性增强，抑制率增加）双链，稳定性增强，抑制率增加）六、非编码六、非编码RNA的多样性的多样性高等生物的转录产物有高等生物的转录产物有97%以上是不编码蛋以上是不编码蛋白质的。白质的。非编码非编码RNA（ncRNA）：不编码蛋白质，以）：不编码蛋白质，以RNA形式发挥作用。形式发挥作用。1. 按按ncRNA的功能分类的功能分类u催化催化RNA（cRNA)：核酶，有催化功能并参与：核酶，有催化功能并参与RNA的加工的加工 u类似类似mRNA的的RNA：u指导指导RNA（gRNA): 指导指导mRNA编辑的小编辑的小RNA分子分子utmRNA：既可以转运氨基酸，又可以作为模板：既可以转运氨基酸，又可以作为模板u端粒酶端粒酶RNA: 作为染色体端粒复制的模板作为染色体端粒复制的模板u 信号识别颗粒（信号识别颗粒（SRP）：参与细胞内蛋白质的转运）：参与细胞内蛋白质的转运u 微小微小RNA（miRNA): 参与基因表达和个体发育的调控参与基因表达和个体发育的调控u 小干扰小干扰RNA（siRNA): 在在RNA干扰中介导靶干扰中介导靶mRNA降解降解ncRNA的分类的分类2. 按按ncRNA的分布分类的分布分类核小核小RNA（snRNA） 剪接体剪接体snRNA U7-snRNA核仁小核仁小RNA（snoRNA) 最丰富的最丰富的ncRNA, 参与参与rRNA及其他及其他RNA的加工成熟的加工成熟胞质小胞质小RNA（scRNA） 位于细胞质，参与蛋白质的合成过程位于细胞质，参与蛋白质的合成过程Cajal 小体小小体小RNA（CBs） 参与核糖甲基化和假尿嘧啶形成参与核糖甲基化和假尿嘧啶形成3. 按按ncRNA的大小分类的大小分类2125nt的的ncRNA 包括包括miRNA家族和小干扰家族和小干扰RNA家族，参与基因表家族，参与基因表达。达。100200nt的的ncRNA 参与细菌细胞的翻译调节参与细菌细胞的翻译调节大于大于10000nt的的ncRNA 参与高级真核生物的基因沉默参与高级真核生物的基因沉默RNA既可以作为遗传物质，又可以实现蛋白既可以作为遗传物质，又可以实现蛋白质的使命质的使命RNA可能是可能是DNA和蛋白质的共同祖先；和蛋白质的共同祖先；生物进化早期可能是一个由生物进化早期可能是一个由RNA主导的世主导的世界界核核 酸酸 的的 理理 化化 性性 质质第第 七七 节节一、核酸一般理化性质一、核酸一般理化性质（一）核酸的水解（一）核酸的水解u 酸、碱、酶水解酸、碱、酶水解u 水解位点在水解位点在磷酸二酯键磷酸二酯键和和糖苷键糖苷键u DNA/RNA对酸对酸/碱的耐受程度有差别碱的耐受程度有差别 碱性条件下，碱性条件下，RNA可被稀碱水解；而可被稀碱水解；而DNA变性，但不被水解；变性，但不被水解；可用此法测定可用此法测定RNA的碱的碱基组成或去除基组成或去除RNA杂质杂质 酸性条件下，酸性条件下，糖苷键糖苷键不稳定，嘌呤与脱氧不稳定，嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键最易被水解；故对核酸部分核糖间的糖苷键最易被水解；故对核酸部分水解时，很少采用酸水解水解时，很少采用酸水解（二）核酸的酸碱性质（二）核酸的酸碱性质1、碱基的解离、碱基的解离v具有芳香环结构特点，能发生酮式具有芳香环结构特点，能发生酮式/ /烯醇式互变烯醇式互变v碱基都具有碱基都具有弱碱弱碱性（主要是环内氨基的贡献）性（主要是环内氨基的贡献）2 2、核苷的解离、核苷的解离 戊糖可增强碱基的解离戊糖可增强碱基的解离 核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离3 3、核苷酸的解离、核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有磷酸基使核苷酸具有很强很强的酸性的酸性 核酸为两性物质，通常具有较强的酸性（核酸为两性物质，通常具有较强的酸性（在中性溶在中性溶液中带负电荷）液中带负电荷）； DNA等电点为等电点为44.5；RNA等电点为等电点为22.5u DNA是白色线性高分子，是白色线性高分子，粘度极大粘度极大；RNA为白色粉为白色粉末，粘度较小末，粘度较小u DNA和和RNA均微溶于水，不溶于有机溶剂，常用均微溶于水，不溶于有机溶剂，常用乙乙醇醇从溶液中沉淀核酸从溶液中沉淀核酸u 加热时，加热时，D核糖浓盐酸苔黑酚核糖浓盐酸苔黑酚 绿色绿色 D-2脱氧核糖酸二苯胺脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色蓝紫色（三）核酸的其他理化性质（三）核酸的其他理化性质二、核酸的紫外吸收性质二、核酸的紫外吸收性质u 碱基含有共轭双键，可强烈吸收碱基含有共轭双键，可强烈吸收250290nm处的紫处的紫外光，外光，最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右u核酸紫外吸收性质的应用核酸紫外吸收性质的应用 利用紫外光照相来定位测定核酸在细胞和组织中的分布利用紫外光照相来定位测定核酸在细胞和组织中的分布 每摩尔碱基在一定每摩尔碱基在一定PH下的紫外吸收值为定值，故利用此下的紫外吸收值为定值，故利用此性质可定量碱基或碱基衍生物在纯溶液中的含量性质可定量碱基或碱基衍生物在纯溶液中的含量 利用碱基的紫外吸收性质可确定其在色谱和电泳谱上的利用碱基的紫外吸收性质可确定其在色谱和电泳谱上的位置位置 载体（浅蓝色荧光），载体（浅蓝色荧光）， 核酸区（暗区）核酸区（暗区）增色效应增色效应 将核酸水解为核苷酸，紫外吸收值会增将核酸水解为核苷酸，紫外吸收值会增加加30%40%，这种现象称为增色效应，这种现象称为增色效应原因：原因：双螺旋结构中，碱基有规律的双螺旋结构中，碱基有规律的紧密堆积降低了其对紫外光的吸收紧密堆积降低了其对紫外光的吸收1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相当于相当于 50 g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或41.67g/ml RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 DNA浓度（浓度（g/ml)=OD260 50; RNA浓度浓度(g/ml)= OD260 41.672.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0含杂蛋白及苯酚，比值会降低含杂蛋白及苯酚，比值会降低OD260的应用的应用三、核酸结构稳定性的因素三、核酸结构稳定性的因素 碱基堆积力碱基堆积力 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，碱基平面间的范碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，碱基平面间的范德华力和疏水作用力共同组成德华力和疏水作用力共同组成碱基堆积力，碱基堆积力，是结构稳是结构稳定的主要因素定的主要因素。 碱基配对的氢键碱基配对的氢键。GC含含量越多，越稳定。量越多，越稳定。 环境中的正离子环境中的正离子 磷酸基上的负电荷与介质中的正离子或组蛋白的正离子磷酸基上的负电荷与介质中的正离子或组蛋白的正离子之间形成之间形成离子键离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于有助于DNA稳稳定。定。四、四、DNA的变性的变性(denaturation)（一）定义（一）定义：在某些理化因素作用下，双螺旋在某些理化因素作用下，双螺旋区氢键断裂，区氢键断裂，DNA双链解开成两条单链双链解开成两条单链无规则线团状态的过程。无规则线团状态的过程。 变性时，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆变性时，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。生物活性发生改变。 但不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变但不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变核酸降解：核苷酸骨架上核酸降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNA变性变性影响核酸变性的因素：影响核酸变性的因素： 过量酸，碱，加热过量酸，碱，加热（一般（一般75）， 变性试剂如尿素、酰胺，变性试剂如尿素、酰胺， 某些有机溶剂（如乙醇、丙酮等）某些有机溶剂（如乙醇、丙酮等）变性后理化性质的改变：变性后理化性质的改变： OD260增高增高、粘度下降、比旋度下降、粘度下降、比旋度下降、 浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、 生物活性丧失生物活性丧失RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有的变性引起的性质变化没有DNA明显明显核酸变性引起紫外吸收值的增加核酸变性引起紫外吸收值的增加-增色效应增色效应DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱完全变性后核酸紫外吸收值增加：完全变性后核酸紫外吸收值增加：v天然天然DNA 2540%、RNA 约约1.1%v实质：碱基暴露实质：碱基暴露由于变性或降解引起核酸紫外吸收增加的现由于变性或降解引起核酸紫外吸收增加的现象称象称增色效应增色效应 OD260 : 单核苷酸单核苷酸单链单链DNA双链双链DNA1. 解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNA稀盐溶液的过程中稀盐溶液的过程中以温度对以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。（二）核酸的热变性及（二）核酸的热变性及Tm变性过程是变性过程是“跃变跃变式式”的，而非渐的，而非渐变变2. Tm：变性在一个窄的温度范围内完成，紫外光变性在一个窄的温度范围内完成，紫外光吸收值达到最大值的吸收值达到最大值的50%时的温度称为时的温度称为DNA的解的解链温度，又称熔解温度链温度，又称熔解温度(melting temperature, Tm)。其大小与。其大小与G+C含量成正比。含量成正比。 双链双链RNA比双链比双链DNA稳定，稳定，Tm高大约高大约20 C 一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间之间3. 影响影响Tm的因素的因素u G-C含量：含量：G-C含量越高，含量越高，Tm越高越高 经验公式经验公式:（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44u 溶液的离子浓度：溶液的离子浓度：浓度越低，浓度越低，Tm越低越低u 离子溶液的离子溶液的PH PH大于大于11.3时，碱基不能形成氢键，时，碱基不能形成氢键，DNA完全完全变性；变性；PH小于小于5.0，DNA易脱嘌呤易脱嘌呤u 变性剂：变性剂：变性剂可破坏氢键，使变性剂可破坏氢键，使Tm下降下降五、五、DNA的复性的复性1. DNA复性复性(renaturation)的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但生复性后，一系列性质将得到恢复，但生物活性一般只能得到部分恢复，具有减色效应。物活性一般只能得到部分恢复，具有减色效应。减色效应减色效应DNA复性时，其紫外吸收降低复性时，其紫外吸收降低变性和复性是可逆的，变性和复性是可逆的， 将热变性的将热变性的DNA骤然骤然冷却冷却至低温时，至低温时，DNA不可能复性。不可能复性。 热变性的热变性的DNA经经缓慢冷却缓慢冷却后即可复性，这一后即可复性，这一过程称为过程称为退火退火(annealing) 。退火温度退火温度Tm252. 影响复性的因素影响复性的因素复性的温度：复性的温度：Tm25是合适的温度，不宜太低是合适的温度，不宜太低 单链片段的浓度：单链片段的浓度：浓度越高，碰撞频率越高，复性越浓度越高，碰撞频率越高，复性越快快单链片段的长度：单链片段的长度：片段越大，错配率越高，复性越慢片段越大，错配率越高，复性越慢单链片段的复杂度：单链片段的复杂度：重复序列越多，复杂度越小，越重复序列越多，复杂度越小，越易形成互补区，复性速度越快易形成互补区，复性速度越快溶液的离子浓度：溶液的离子浓度：维持一定的正离子浓度，消除磷酸维持一定的正离子浓度，消除磷酸基负电荷引起的斥力，可加快复性基负电荷引起的斥力，可加快复性六、六、 核酸的分子杂交核酸的分子杂交u 热变性的热变性的DNA在复性过程中，具有碱基序列部在复性过程中，具有碱基序列部分互补的不同的分互补的不同的DNA之间或之间或DNA与与RNA之间形成之间形成杂化双链的现象。这样形成的新分子称为杂化双链的现象。这样形成的新分子称为杂交杂交DNA分子分子。u 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。有重要意义。探针探针v探针技术：探针技术：在核酸杂交的基础上发展起来的一在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的新技术。种用于研究和诊断的新技术。v探针探针(probe)：经同位素或荧光标记的具有特经同位素或荧光标记的具有特定碱基序列的单链核苷酸聚合体。定碱基序列的单链核苷酸聚合体。v探针可用于：探针可用于：基因诊断、致病基因的定位、基因诊断、致病基因的定位、Southern blotting、Northern blotting、原、原位杂交、位杂交、DNA芯片技术等临床实践和科研。芯片技术等临床实践和科研。 核酸分子杂交核酸分子杂交是根据两条核酸单链在一定条件下是根据两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则退火形成双链的原理，用已知的可按碱基互补原则退火形成双链的原理，用已知的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法。互补的同源核酸序列的方法。 常用的核酸分子杂交方法：常用的核酸分子杂交方法： Southern 印迹杂交、印迹杂交、Northern 印迹杂交印迹杂交 斑点杂交、狭缝杂交斑点杂交、狭缝杂交 原位杂交（菌落原位杂交、细胞原位杂交、原位杂交（菌落原位杂交、细胞原位杂交、 组织片原位杂交）组织片原位杂交） 原位杂交法筛选原位杂交法筛选DNA重组体重组体图解图解复印至硝酸复印至硝酸纤维素膜上纤维素膜上用用NaOH菌体菌体裂解裂解DNA变性变性杂交杂交放射自显影放射自显影32P-cDNA与放射性与放射性cDNA杂交杂交的菌落的斑点的菌落的斑点细菌菌落细菌菌落单链单链DNA结结合到膜上合到膜上Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置测定两种核酸分子间的序列相似性测定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是是基因芯片基因芯片技术的基础技术的基础 基因芯片技术基因芯片技术 将相关基因的探针排列在特定芯片上，将相关基因的探针排列在特定芯片上，样品样品DNA用荧光基团标记后与芯片进行杂交，用荧光基团标记后与芯片进行杂交，通过检测杂交信号及其强度，进行基因诊断、通过检测杂交信号及其强度，进行基因诊断、并可对基因序列及其功能进行大规模、高通并可对基因序列及其功能进行大规模、高通量的研究。量的研究。DNA芯片工作示意图芯片工作示意图emissionLaser 1Laser 2computer analysisDNA clonestestreverse transcriptionLabel with fluor dyesPCR amplification purficationhybridize target to microarrayrobotic printingreference七、核酸酶七、核酸酶 核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶是指所有可以水解核酸的酶依据底物不同分类依据底物不同分类uDNA酶酶(DNase)：专一降解专一降解DNAuRNA酶酶 (RNase)：专一降解专一降解RNAu非特异性核酸酶：既能水解非特异性核酸酶：既能水解DNA又能水解又能水解RNA依据切割部位不同依据切割部位不同u核酸内切酶：核酸内切酶： 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 非特异性限制性核酸内切酶。非特异性限制性核酸内切酶。u核酸外切酶：核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切酶。核酸外切酶。u参与参与DNA的合成与修复及的合成与修复及RNA合成后的剪合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程接等重要基因复制和基因表达过程 u负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 u在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 u体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 核酸酶的功能核酸酶的功能 本章小结本章小结v核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸是遗传物质载体的证明和研究历史v核酸的化学结构：戊糖、碱基（核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）vDNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组）、二级结构（组）、二级结构（ 双螺旋模型、双螺旋模型、ZDNA等）、三级结构等）、三级结构（超螺旋、核小体）、结构维持的化学键（超螺旋、核小体）、结构维持的化学键vRNA结构与功能：碱基组成特点、结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能的种类结构及功能v核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交 作业一作业一1. 对双链对双链DNA而言，若一条链中而言，若一条链中(A + G)/(T + C)= 0.7，则互补链中和整个则互补链中和整个DNA分子中分子中(A+G)/(T+C)分别等分别等于多少？于多少？2. 维持核酸结构稳定性的因素有哪些？维持核酸结构稳定性的因素有哪些？ 作业二作业二1. 什么是什么是Tm？影响？影响Tm的因素有哪些？的因素有哪些？2. 简述简述RNA的种类及其主要功能。的种类及其主要功能。