第二章--基因定位和遗传作图ppt课件.ppt
1第二章第二章基因定位和遗传作图基因定位和遗传作图2概述概述细胞做图：利用三点测验法计算交换率或重组率，并以此作为基细胞做图：利用三点测验法计算交换率或重组率，并以此作为基因间连锁关系和相对距离绘制连锁图，常以因间连锁关系和相对距离绘制连锁图，常以mu为单位为单位染色体定位：利用同线法、缺失法、单体法、三体法把基因定位染色体定位：利用同线法、缺失法、单体法、三体法把基因定位到特定的染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞遗传图到特定的染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞遗传图区域定位：利用染色体步行、区域定位：利用染色体步行、FISH和基因克隆等方法从细胞遗和基因克隆等方法从细胞遗传学水平，将基因定位到染色体的具体区带。传学水平，将基因定位到染色体的具体区带。分子定位：利用分子标记、分子定位：利用分子标记、DNA芯片技术，将基因确切定位在芯片技术，将基因确切定位在DNA上的具体位置上。上的具体位置上。3第一节第一节 顺反子学说顺反子学说一、重组试验和连锁图一、重组试验和连锁图 1. 噬菌体突变型噬菌体突变型噬菌体噬菌体T4的突变型的突变型r和野生型和野生型r+ 在不同菌株上的表现在不同菌株上的表现 噬菌体噬菌体T4 E.coli B株株 E.coli K（）株）株 r +（大而清晰的噬菌斑）（大而清晰的噬菌斑） r+ +（小而模糊的噬菌斑）（小而模糊的噬菌斑） +（小而模糊的噬菌斑）（小而模糊的噬菌斑） 2. 噬菌体突变型间的杂交噬菌体突变型间的杂交 图图 3. 连锁图连锁图 r47 r104 r101 r106 | r51 r102 | 1.3 1.0 1.6 | 1.9 1.6 A区区 | B区区4第一节第一节 顺反子学说顺反子学说二、互补试验和顺反子学说二、互补试验和顺反子学说1.顺反位置效应和互补试验顺反位置效应和互补试验（1）同一顺反子中的突变位点（等位）同一顺反子中的突变位点（等位） 基因型基因型 表型表型 是否互补是否互补 m1 m2 | 顺式顺式 + + 野生型野生型 | m1 + | 反式反式 + m2 突变型突变型 无无 | （2）不同顺反子中的突变位点（非等位）不同顺反子中的突变位点（非等位） 基因型基因型 表型表型 是否互补是否互补 m2 m3 | 顺式顺式 + + 野生型野生型 | m2 + | 反式反式 + m3 野生型野生型 + | 2. 顺反子学说内容（顺反子学说内容（cistron、muton、recon） 例例 5第一节第一节 顺反子学说顺反子学说三、基因内互补三、基因内互补intragenic complementation1 .概念和机理概念和机理机制：可能是由于两个突变基因所产生的失活产物结合，成为具有活性的蛋机制：可能是由于两个突变基因所产生的失活产物结合，成为具有活性的蛋白质。白质。如果将两个有关纯合体的抽提物混合时看到互补现象，叫离体互补或体外互如果将两个有关纯合体的抽提物混合时看到互补现象，叫离体互补或体外互补。补。6第一节第一节 顺反子学说顺反子学说2 基因内互补与基因间互补的区别基因内互补与基因间互补的区别基因间互补基因间互补基因内互补基因内互补发生机率发生机率普遍存在普遍存在只少数能发生只少数能发生缺失突变缺失突变能发生互补能发生互补不能发生不能发生酶活性酶活性同野生型同野生型明显低于野生型（仅明显低于野生型（仅25%）互补结果互补结果可完全恢复野可完全恢复野生型表型生型表型 最多只能使表型恢复到野生型的最多只能使表型恢复到野生型的25，而且突变位点相距愈近则，而且突变位点相距愈近则互补程度愈弱互补程度愈弱 发生地点发生地点在任何两个非在任何两个非等位基因之间等位基因之间 同一基因内的若干不同的突变型同一基因内的若干不同的突变型之间之间 7第二节第二节 遗传作图和染色体定位遗传作图和染色体定位一、有性杂交重组定位一、有性杂交重组定位 (三点测交法三点测交法) 例题例题二、细菌基因定位二、细菌基因定位 例题例题1. 中断杂交作图中断杂交作图2. 基因重组作图基因重组作图3. 转化基因定位转化基因定位4. 转导基因定位转导基因定位5. 性导基因定位性导基因定位三、体细胞杂交定位三、体细胞杂交定位物种间体细胞杂交物种间体细胞杂交杂种细胞杂种细胞各种各种clone 同线法同线法基因定位基因定位四、四、 缺失定位缺失定位1. 单体定位法单体定位法2. 染色体缺失定位法染色体缺失定位法图图8第三节第三节 染色体区域定位染色体区域定位一、染色体步行一、染色体步行(chromosome walk) 法法 1. 概念概念2. 类型：类型：反向反向PCR、锅柄、锅柄PCR、不对称、不对称PCR、SON PCR二、荧光原位杂交法二、荧光原位杂交法 （florescence in situ hybridization，FISH）1. 概念概念优点：可用来作基因或特定优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区域定位。片段的染色体区域定位。缺点：必须在已知探针的情况下方可进行缺点：必须在已知探针的情况下方可进行2.2.原位杂交的步骤原位杂交的步骤 图图三、基因克隆三、基因克隆1. 功能克隆功能克隆(functional cloning)2. 定位克隆定位克隆(positional cloning)：也叫图位也叫图位克隆克隆(Map-based cloning) 第四节第四节 分子标记分子标记分子标记的类型：分子标记的类型：（1） 基于杂交的分子标记：RFLP标记，小卫星DNA标记（SSR）（2）基于PCR的分子标记：单引物PCR标记，如RAPD、ISSR标记；双引物PCR标记，如AFLP标记；双引物特异PCR标记，如SSR标记（3） 其他一些新型分子标记：如SNP标记、STS标记、EST标记 分子标记的优点分子标记的优点（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各发育时期均可检测。（2）数量极高，遍及整个基因组。（3）多态性高，等位基因变异随处可见。（4）表现为“中性”，即不影响目标性状的表达。分子标记的意义分子标记的意义10第四节第四节 分子标记分子标记一、一、RFLP限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）：）：1. 优点：优点：RFLP是发展最早（是发展最早（Bosterin等等1980）的分子标记技术。）的分子标记技术。 无表型无表型效应；效应；一般表现为共显性；一般表现为共显性；具有种族特异性，它对分析一个分离群体中具有种族特异性，它对分析一个分离群体中来源不同的染色体片段具有重要价值；来源不同的染色体片段具有重要价值；标记范围遍及全基因组；标记范围遍及全基因组；在不同在不同的物种之间具有通用性。的物种之间具有通用性。2. 缺点：操作复杂、成本高、缺点：操作复杂、成本高、费时等。费时等。二、二、RAPD随机扩增多态性随机扩增多态性DNA技术技术 （Random amplified polymorphic DNA)优点：（优点：（Willians1990） 能反映整个基因组的变化；能反映整个基因组的变化； 不需不需DNA探针，探针，无需合成特定序列引物；无需合成特定序列引物； 高效灵活，可在短期内获得大量的多态性高效灵活，可在短期内获得大量的多态性DNA片段，亲缘关系非常近的个体也能识别；片段，亲缘关系非常近的个体也能识别； 操作简单易行，不需要接触放操作简单易行，不需要接触放射性物质，简便、快速、费用低、分子识别率高、对环境污染小等。射性物质，简便、快速、费用低、分子识别率高、对环境污染小等。缺陷：重复性和稳定性较差缺陷：重复性和稳定性较差11第四节第四节 分子标记分子标记三、三、AFLP扩增片段长度多态性（扩增片段长度多态性（Amplified fragment length plymorphism）优点：优点：（ Zabeau和和Vos，1992），），(1) 可标记的数目是无限的；可标记的数目是无限的； (2) 多数具多数具有共显性；有共显性；(3) DNA用量少，而且对模板浓度的变化不敏感；用量少，而且对模板浓度的变化不敏感；(4)扩增片段较扩增片段较短，分辨率高；短，分辨率高；(5)利用特定引物扩增，退火温度高，可靠性高。利用特定引物扩增，退火温度高，可靠性高。 缺陷缺陷：操作技术复杂，需要酶切、连接等步骤。：操作技术复杂，需要酶切、连接等步骤。四、四、SSR标记标记 SSR，简单重复序列简单重复序列 （ Simple sequence repeat）又叫微卫星标记。）又叫微卫星标记。应用应用：多态性分析和新基因的发现、定位与作图。：多态性分析和新基因的发现、定位与作图。特点特点：(1) 数量丰富，覆盖整个基因组；数量丰富，覆盖整个基因组；(2) 呈现多基因特点，信息含量高，呈现多基因特点，信息含量高，表现为共显性遗传；表现为共显性遗传；(3) 可采用可采用PCR技术进行检测，且重复性好；技术进行检测，且重复性好；(4) 对对DNA数量及纯度要求不高，即使是部分降解的样品也可；数量及纯度要求不高，即使是部分降解的样品也可；(5) 标记带型简单，条标记带型简单，条带一致、客观、明确。带一致、客观、明确。12第四节第四节 分子标记分子标记五、五、 SNP SNP（single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性）单核苷酸多态性）优点优点：(1) SNP分布广泛，多态性丰富；分布广泛，多态性丰富；(2) 易于实现自动化分析；易于实现自动化分析；(3) 具有具有稳定的遗传特性。稳定的遗传特性。 (4) SNP基因座的片段更短，更适合基因座的片段更短，更适合PCR扩增；扩增；(5) 易于对易于对复杂性状进行关联分析。复杂性状进行关联分析。SNP标记可与标记可与DNA芯片技术结合：芯片技术结合：将不同的寡核苷酸固定在芯片上，标记待将不同的寡核苷酸固定在芯片上，标记待测测DNA，一次就可检测很多，一次就可检测很多SNP标记。标记。六、六、STS序列标签位点序列标签位点 （Sequence-tagged site，M.Olson，1989)1. 类型：（类型：（1）特异）特异DNA序列；（序列；（2）无序的）无序的DNA片段：未知片段序列标签片段：未知片段序列标签2. 特点：产生的信息十分可靠。对基因的研究、新基因的克隆以及基因图谱特点：产生的信息十分可靠。对基因的研究、新基因的克隆以及基因图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。向物理图谱的转化研究具有重要意义。13第四节第四节 分子标记七、七、SCAR（Sequence-character amplified regions，特异序列扩增区域标记）是在，特异序列扩增区域标记）是在RAPD的基础上发展起来的。的基础上发展起来的。优点：可把与原优点：可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。片段相对应的单一位点鉴定出来。八、八、ISSRISSR （inter-simple sequence repeat,简单序列重复区间扩增多态性）：是对简单序列重复区间扩增多态性）：是对SSR的发展，由的发展，由Zietkiewicz等等(1994)创建创建优点：稳定性好、所需优点：稳定性好、所需DNA样品量少，技术简单，多态性高。可用于遗传样品量少，技术简单，多态性高。可用于遗传多样性分析、遗传作图、品种鉴定、基因定位及分子标记辅助育种等研究。多样性分析、遗传作图、品种鉴定、基因定位及分子标记辅助育种等研究。九、基因与氨基酸同源序列比对九、基因与氨基酸同源序列比对图图（蛋白质分子标记）（蛋白质分子标记）14第五节第五节 DNA芯片技术芯片技术一、概述一、概述1. 基本概念基本概念 DNA芯片芯片（DNA Chip Technology） 、DNA微阵列微阵列（DNAmicroarray）、寡核苷、寡核苷酸阵列酸阵列（oligonucleotide array）。）。生物芯片包括：生物芯片包括：DNA芯片、蛋白质芯片芯片、蛋白质芯片2. DNA芯片的主要类型芯片的主要类型（1） 根据探针的来源分根据探针的来源分原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短而制备的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活（2）根据探针的大小分）根据探针的大小分 15第五节第五节 DNA芯片技术芯片技术二、二、DNA芯片技术的基本芯片技术的基本步骤步骤1. 芯片制备芯片制备（1）支持物的预处理：支持物）支持物的预处理：支持物(硅芯片、玻片或瓷片硅芯片、玻片或瓷片)预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。（2）DNA芯片阵列的制备：将制备的基因探针（已克隆的基因片段芯片阵列的制备：将制备的基因探针（已克隆的基因片段PCR或或人工合成的人工合成的DNA片段）、片段）、打印（打印（喷墨打印或针式打印）喷墨打印或针式打印） 2. 准备样品准备样品:分离纯化分离纯化cDNA , mRNA扩增扩增标记标记(荧光、生物素、放射性标记）荧光、生物素、放射性标记） 3.分子杂交分子杂交样品与样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交芯片上的探针阵列进行杂交(30min) 4. 检测分析检测分析软件进行进行图象分析和数据处理软件进行进行图象分析和数据处理16第五节第五节 DNA芯片技术芯片技术三、三、DNA芯片技术的应用芯片技术的应用1. DNA测序测序2. 基因表达分析基因表达分析3. 基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析4. 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因四、基因芯片技术的优点四、基因芯片技术的优点1. 规模大规模大2. 高度平行性高度平行性3. 快速高效快速高效4. 高灵敏度高灵敏度5. 高度自动化高度自动化17顺反子的测定用用T4噬菌体一个特殊基因区的不同突变株研究互补作用，获得下噬菌体一个特殊基因区的不同突变株研究互补作用，获得下列资料，请判断，本区应有几个顺反子？各包括哪些突变型？列资料，请判断，本区应有几个顺反子？各包括哪些突变型？ 1 2 3 4 5 6 18顺反子的测定E.coli 的的8个用个用T4突变株都不能在没有组氨酸的培养基上生长突变株都不能在没有组氨酸的培养基上生长(his-),两两进行重组测验，发现所有的顺式杂合体都能在基本培养基上两两进行重组测验，发现所有的顺式杂合体都能在基本培养基上生长。而反式杂合体中，有的能在基本培养基上生长生长。而反式杂合体中，有的能在基本培养基上生长(+)，有的，有的则不能则不能(0)，如下表所示，确定这，如下表所示，确定这8个突变位点分属于几个不同的个突变位点分属于几个不同的顺反子？顺反子？突变体突变体 7 88 0 0 0 0 0 0 + 07 + + + + + + 06 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 04 0 0 0 03 0 0 02 0 01 019顺反子的测定假如上题的假如上题的8个突变体测试产生了下列结果，结论是什么？个突变体测试产生了下列结果，结论是什么？反式杂合体在基本培养基上的生长情况反式杂合体在基本培养基上的生长情况突变体突变体 1 7 88 + + + + + + 0 07 + + + + + + 06 + + + + 0 0 5 + + + + 04 + + 0 03 + + 02 0 01 0例题普通生物的基因定位普通生物的基因定位ABC42 abc42 Abc8 aBC8 ABc92 abC92 AbC358 aBc358 1000细菌基因定位细菌基因定位某杂交：某杂交：Hfr ABC strs F abc strr 经检测后代的基因经检测后代的基因型和菌落数分别是：型和菌落数分别是：ABC ABc AbC Abc aBC aBc abC 总计总计 800 30 80 40 10 40 40 104021体细胞杂交定位杂种细胞系杂种细胞系ABCDE人的基因人的基因OPQR +人的染色体序号人的染色体序号123+根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体的情况，进行基因根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体的情况，进行基因定位定位22缺失作图缺失作图AJ系是顺反子系是顺反子Y的一系列缺失。突变品系的一系列缺失。突变品系110同同AJ分别进行杂交，得到下分别进行杂交，得到下列结果（列结果（+和和0表示后代能否产生野生型）。指出顺反子表示后代能否产生野生型）。指出顺反子Y中从左到右的突变中从左到右的突变品系品系110的顺序。的顺序。 | 顺反子顺反子Y | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | A | A 0 0 0 0 0 + 0 0 + 0 | G | B + 0 0 + + + 0 0 + 0 | B | C + 0 0 + + + 0 + + 0 | H | D + + 0 + + + 0 + + + | C | E 0 0 + 0 + + + 0 + 0 | I | F + + 0 + + + + + + + | D | G 0 + + + 0 0 + + 0 + | E | H 0 + + 0 0 0 + 0 0 0 | F | | J | I + + + + 0 0 + + 0 + J + + + + + + + + 0 +3 7 2 10 8 4 1 5 6 9 23FISHFISH步骤步骤 制备中期染色体制备中期染色体 在载玻片上在载玻片上DNA原位变性原位变性 杂交（在载玻片上，将放射性标记探针与之杂交）杂交（在载玻片上，将放射性标记探针与之杂交） 复性复性 洗膜洗膜 放射自显影放射自显影 检测、结合染色体形态进行基因定位检测、结合染色体形态进行基因定位
