实验一细菌基因组DNA的提取ppt课件.ppt
一、实验原理一、实验原理1、核酸的分类、核酸的分类lDNA DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNADNA，如线粒体如线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA），叶绿体），叶绿体DNADNA（cpDNAcpDNA），质粒），质粒DNADNA。lRNARNA 存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l除上述除上述DNADNA，RNARNA外，还有非细胞形式存在的病毒和外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含噬菌体，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。l分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则： 应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。l核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求： 核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子；核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则l 核酸制备的步骤：核酸制备的步骤：细胞破碎细胞破碎 机械方法：机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用化学试剂法：用SDS处理细胞；处理细胞； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取提取 SDS（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠 ）法）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂是有效的阴离子去垢剂, 细胞中细胞中DNA与与蛋白质之间蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵（十六烷基三甲基溴化铵 ）法）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使性，使DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。DNA纯化（去杂质）纯化（去杂质） 蛋白质：蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。抽提。 RNA ：常选用：常选用RNase消化消化 ，或是用，或是用LiCl来消除大分子的来消除大分子的RNA。 酚类物质：酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖：多糖： 提取液中加提取液中加1PVP。 核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程核酸样品的保存核酸样品的保存温度： 44（55）最佳和最简单）最佳和最简单 -70 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20 -20保存保存保存介质： TETE缓冲溶液缓冲溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂 菌种菌种 ：大肠杆菌：大肠杆菌DH5设备设备 ：eppendorfeppendorf管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（涡旋振荡器，水浴锅（ 37 、60 ）试剂：试剂：LBLB液体培养基液体培养基 、无水乙醇、细菌基因组、无水乙醇、细菌基因组DNADNA提取试剂提取试剂盒。盒。1、细菌、细菌 37 过夜培养，取过夜培养，取1ml培养物培养物 12000rpm 室温离心室温离心 1min。2、沉淀物加入、沉淀物加入180ul TE缓冲液，充分重悬细菌；再加入缓冲液，充分重悬细菌；再加入20ul 50mg/ml溶菌酶，混匀后于溶菌酶，混匀后于30温育温育10min。3、12000rpm 离心离心 5min, 弃上清后加入弃上清后加入200 ul Buffer BTL，漩涡震荡悬浮细胞。，漩涡震荡悬浮细胞。4、加入、加入25ul 蛋白酶蛋白酶K溶液，振荡器混匀，于溶液，振荡器混匀，于55温育温育30min，每隔，每隔10min 漩涡震荡一次。漩涡震荡一次。5、加入、加入220ul Buffer BDL，颠倒混匀，于，颠倒混匀，于65温育温育10min。6、加入、加入220ul 无水乙醇，以最大速度漩涡震荡无水乙醇，以最大速度漩涡震荡20s。7、转移样品至、转移样品至DNA 纯化柱中，纯化柱下端安装纯化柱中，纯化柱下端安装2ml收集管收集管,12000rpm离心离心1min使使DNA结结合在纯化柱上，弃去收集管。合在纯化柱上，弃去收集管。8、将、将DNA纯化柱安装到新的纯化柱安装到新的2ml收集管中，加入收集管中，加入500ul Buffer HB，12000rpm离心离心1min，弃去滤液。弃去滤液。9、DNA纯化柱中加入纯化柱中加入700ul DNA Wash Buffer，12000rpm离心离心1min，弃去滤液。，弃去滤液。10、重复步骤、重复步骤9一次。一次。12000rpm离心离心2min，干燥，干燥DNA纯化柱。纯化柱。11、将、将DNA纯化柱转移至纯化柱转移至1.5ml EP管中，加入管中，加入50ul 预热预热（65）的的Elution Buffer, 室温放室温放置置3min，12000rpm离心离心1min。三、操作步骤三、操作步骤 最好使用新鲜材料，低温保最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融 材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量量少，纯度低少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡
