gfp基因的克隆与表达.doc

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 姓名：刘会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5 (pEGFP-N3)和DH-5(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1. 材料与方法：1.1.1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not 1.1.2 仪器设备Eppendof离心机、电泳仪 、电子天平 、台式离心机 、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器 、紫外灯、生物洁净工作台 、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头 、接种环 、酒精棉球 、灭菌枪头 、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液 50 mL葡萄糖 50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L121高压灭菌 15 min后置于04贮存；溶液 100 mLNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液 100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 11.5 mLH2O 28.5 mL 121 高压灭菌 15 min后置于04 贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的0.1 mol/L CaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液 0.5 µg/mL；LB/Kan（50 µg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在04 ；无水乙醇 ：放在04 ；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于20 ； 1.2方法： 1.2.1 大肠杆菌DH-5 (pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取的原理和操作。1.2.3，器材：，微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱，消化缓冲液: CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。1.2.4实验原理生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。1.2.5、实验步骤1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。  2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋 白酶 K, 混匀, 37保温1小时。  3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。  4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65保温20分钟。  5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移 至干净离心管。6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及. 倍体积预冷（）无水乙醇，混匀。 沉淀min。12000rpm15min，弃上清8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。9、管放置于烘箱中烘干。10、加ul TE或ddH2O溶解。11、琼脂糖凝胶电泳检测 注意，实验室中一般用的1.5ml的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量。 DH-5(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。1.3.1扩增1.3.2实验目的 、学习扩增的基本原理。、掌握技术的常规操作。、了解扩增的参数设计。1.3.3实验原理、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。、反应体系 引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。、循环参数 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min1.3.4器材1，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统2，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液3，引物：1.3.5实验步骤、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 dd water 10.5ul 10×PCR buffer（不含MgCl2） 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L 引物1 1ul 10mol/L 引物 2 1ul 模板 1ul Taq酶 0.5ul 总体积 20ul、在离心机中混匀。、管放入仪中，按照原理中的条件设置程序，进行反应。、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接1.4.1、实验目的1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。2. 掌握DNA体外连接的方法。1.4.2，实验原理1，DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关：DNA分子大小DNA分子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。1.4.3，仪器1，凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴锅2，PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker1.4.4，实验步骤 1，2%琼脂糖凝胶电泳2，在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3，加入5个凝胶体积量的DR- Buffer 4，混匀 65加热融化凝胶块5，加入DR-Buffer量的1/2 体积的DR- Buffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇6，将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液7，加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液8，加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液9，同810，将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测11，链接反应（冰上操作）在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂：纯化的目的DNA片段 4.5ulVector 0.5ul连接液 5ul 混匀 16连接过夜 1.5 DH-5 和BL-21感受态细胞的制备1) 将04 保存的DH-5 和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 下250 r/min过夜培养16 h 。2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 活化培养23 h至OD=0.30.5 。3) 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 下5000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 下5000 r/min离心10 min。4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在20 冰箱内保存。1.6 感受态细胞的转化1) 取制备好的感受态细胞100 l，冰上解冻，均匀悬浮。2) 加入2 l酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。3) 42 水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。4) 加入200 l LB液体培养基，37 ，50-100 rpm振荡培养1 h。5) 取200 l悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置12-16 h。 1.7碱法提质粒 1) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 , 180 r/min振荡培养过夜。2) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。3) 向离心管中加入150 ml用冰预冷的溶液，用微量移液器吹打重悬沉淀。4) 加入200 ml新配制的溶液 ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。5) 加入150 ml用冰预冷的溶液 ，轻轻混匀，冰上放置35分钟。6) 用微量离心机于4 、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。7) 加等体积氯仿400 ml抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。8) 吸取上清液300 ml，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 、11000 rpm离心5分钟，弃上清。9) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 ml超纯水溶解质粒DNA，加入2 ml 10 mg/ml RNA酶，37 处理1小时后于-20 贮存。 1.8酶切鉴定1) 取提取的质粒8 ml于另一微量离心管中，加入2 ml Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。2) 离心，使溶液聚集在管底部。3) 37 ，酶切反应。1.9琼脂糖凝胶电泳1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 左右。2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。4) 吸取10 ml的质粒与2 ml的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V, I=30 mA。6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。2.0 PCR-聚合酶链式反应1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分PCR反应体系各成分的量模板DNA0.1 mlP1(20 mM)0.2 mlP2(20 mM)0.2 mldNTPs(10 mM)0.4 mlTaq酶(5 U/ml)0.2 ml10×PCR buffer2 mlddH2O16.9 mlTotal20 ml2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 3 min，变性95 30 s，退火60-55 30 s，延伸72 1 min 10个循环，每个循环降0.5 。变性95 30 s，退火55 30 s，延伸72 1 min 20个循环，72 延伸 2 min。3) PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。4) 取8 ml扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。2.1 pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21 1) 取100 l感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 l经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。2) 42水浴热激70 s，冰上放置2 min。3) 加入200 l 含抗生素的LB液体培养基，37 ，60 r/min震荡培养30 min。四支EP管中加入0.5 l 的100 mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。4) 吸取200 l菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置12-16 h。2.2重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达1) 取GFP重组菌接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 150-220 r/min过夜培养。2) 将20 l菌液按1：50100接种于2 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 200r/min培养2h。3） 按IPTG: LB培养基按1:1000加入2 l的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。4） 用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。 8 片 存， 菌照用导 诱 基组对续，实诱 的计 00 培 :按 养 /0 ， 0 液 接00：菌0 养培过 0- 中/ 0 含养 菌 表诱的（光绿重 置 皿封封 静放布均布，平的抗涂菌0取吸导诱 不管 诱 0的 加中支 0培 0 养液 生 0 上 激水 0 上匀轻 质提定酶 。匀，慢上-态感0取 - 表转重 - 测检脂进产后 上上管 出完 延 ，个 火 0 环循循0 伸 0 火退 性， 变数的仪设仪 放 m mm m mm / mm 0 m mm 0mm 的体应成各应 加表上冰管 将反链聚 果察统分胶凝泳电， 前到移酚当 = 0据泳设的泳泳接孔样入液吸混的 与 子除轻毫.面没液液中电液缓带封除上钟0却静胶子加端入缓右 却融完加水置液 × 0加中到放脂 取电凝琼应反 部底聚使心物反外弹，酶 和 入，离一 的取鉴切。贮 于时 酶 / 入加 溶纯 0管的向燥中沉， 0 次醇乙 清弃分离 0 于离用钟放于匀乙无体 清向0液取 中中另转将分 0 机心，匀， 0氯体加管管到清吸钟心 0 机量钟分 冰混轻 冷用 加钟 上次管颠快口液配m0 淀沉打移用液的用 0中管清上， /00 心量管离倒物 夜过培 / 基体 生抗 没落取吸灭 粒法。- 培 好口后 置放平匀布用养固的生合布胞0 养 0-， 基体 加 放 浴 00置匀轻物 浮悬冻冰0细感备 转胞态存存冰 放菌和油 / 冷 .用液 0 后 0 放。和 / 0的 加，弃 0 , 于， 液 . .至 化 ，养 接比: ：种 培 /0 中养液在接 - 制胞受 过连 . . 目剂下以 .作操（接检胶管 保 0 烘 加中 管 的于安 同滤 0 0 0滤 0 0 滤滤 , 0 转 述上丙的 为入 0小片当 的 量 胶化加 的体个重块为 中 的 装糖 的下手干用紫电凝糖，步实 0 盒克，试收 ，加 ×产浴水 管 ， 灯仪，刀泳胶仪仪粒整的形配照用接 在 开与酸腺个多端中核物中 参 纯脱被使可浓， 吸能浓高硅冲电用浓胶构分大分关素以率电中琼在 原验 法的连 法法 收回凝从和目实.连体及 回电凝检泳胶琼产 取结应应行进置条理按入匀中机 0 总 引 0 ） （ 0 . 系反0制管微 .步验物冲缓, 冲 ，物 液冲，酶 系像外统电糖，心式 ，离 头吸，液量器 0 0 参循 酶 、 、 、 体反程的合的介外，模扩，性、核用)， 反原验计数的作操常理原增习的验 扩.取取样可粒的 量节调要据可 的.般一 泳电脂溶 干干于管清上 0 轻 0上弃 0 淀 。醇）冷体 及 体 。管干液上提 (醇仿等管管至 清,0 0 ) (:氯体用.。0温 , 溶   加. 混    . .。 保 混 白 ) ( 0 0  0 . 沉 加  清,钟离 0,液菌 .骤、.染污 入时必响 的制 去酶用白的紧 的，水 ，界水相心而质，提、经影 用变有白仿酚法氯采一除把因过 的到影污制 蛋合蛋常体 。类胞集部或分原原 ，粉  蛋 %， 0丙): 异:酚 (异：剂 0至 加,   于 液 / 液化冰、胶、 、锅箱吸 .、高、移：器作操理法氯：的 .提的体染- ( 肠 ：；存小，至慢后， 溶使 0在溶 成，试配 / (· 0 ；0：水在成子灭醇开：%；备 液 0 成 素卡备存 ，溶0 浓 ；培）/ / 存 锭；的质相标 .灭缓聚 酶 ；缓0水去的；存贮 0 压 0 ) 0 配释 0、 / / 存存置 高/ )0 ( / )0 / 糖 0 ）%粉琼 在是固 灭 于 液及试 管离、板 灭、酒、头、培灯统析成、电胶糖箱温热台净生外、振恒台冰 热调器磁、心台平电 泳心 设设 、 切制物 - 和 ，藏验为 表- .材验 法方。中杆因 判色显可，因 导 再表行 体肠入因） 蛋荧法化转,鉴行粒所 与 内性限化转胞感- 入重，- 重连酶粒) 别通法达的中大克的基 光色： 淼会： 0生： 及隆)(基光