RT-PCR原理和实验步骤.doc

RT-PCR原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA          RNA        Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因         104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）        共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5   3方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则： 1) 引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2) 引物设计原则的把握引物设计原则包括 :a、引物长度:一般为1530bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：4060，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去510度。 c、 3 端要求：3 端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3端不应超过2个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。 g、5端无严格限制：5末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。 2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。 3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。 三、RNA的提取方法RTPCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。  RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤来源：生物谷 访问量：3688评论(0)分享1一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5g/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。四、实验步骤（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4l于封口膜上。在实验台上再加入5l 1×TAE电泳缓冲液及1l 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂：（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗乙醇干燥3%H2O2灌满室温放置10分钟0.1%DEPC水冲洗。操作：（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（2） 配制琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60-70 ，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。（3） 样品准备： 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。 将离心管置于60水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 向管中加入3ul 上样染料，混匀。（4）上样。（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。8果查灯外后电泳下的 ， 入槽泳样样匀，染 入中钟钟冰再分中 心匀, 样 去（ 甲 液缓 如加，小0的理 备备胶糖匀均混溴 0和 醛 入其依 至匀化底糖加波， ，形 0的，琼 0胶糖琼用备遍一%用胶制作洗冲 钟置放满 % 醇冲）泡般（污洗清电甲去醛甲）蓝甲%.蓝% / 甘 料上 , 00 (）（烷啉 /.:0液 剂检凝糖的果果 测透紫洗稍清 染 凝 约电极由使 电关源孔点加，缓 及冲 加台验上于 总器移台工胶凝液冲泳 ×胶琼制泳 ×步验实液冲 ） 化溴0冲缓 ，琼 测透，波，液天子泳泳。 总药及、验可即糖%的，整完 提速需胶用要量分定此系性数量才泳的下条变完。分断但能带 不凝的-0用泳性进件种及在泳原验实法和的胶非 物目验 "享 " ? / )( " " = . / ./ " ：谷步理原电凝。 性制酸异性质力和 白阻酶过， 外去 （乙用采， 性制抑 性除包环酶 一创应 提。 也境外 性除广，常性 污 减是因最离 完度 括重量的的分细 方提 。水高 精酒 异氯酸和、备备） 菌活灭后降 过操酶 除处水 %经先之 头存材的接用材。设自件这对. ，0 如设常物当的验。）酶记（行以定结的 或是，以基制严。在补的连于同序异特物序个过应 补续 多不物构级之物。物引结成身会，互应身构二身。的以出免可尽、选好的此间中 率效配是位能构二任有，修任，互板必 要。减低较度复 00： 含。一的 出是在集的或，分应碱四布。异应响度最酶过会伸的 物性的 会太 0般一 包计把则设物子内的中他在特程表的或物含两盖选。的特引对 在可方剪 同型的种同源存能考时设在响关有个对否计此。异反决特物：则计设备备 . 链双成板 一以酶聚 ； 杂 水性 ；条 成模以：聚 ：活下具至聚 赖内病于存 酶 录复复如个三伸伸方 引退在 及 和聚 伸。结模使，一液混将 链，氢的 使加性：三应决序的工由特应酶合 赖依的存脱四、。反式聚)   术 的重是调水于平 因拷此蛋个0共   白个成可 每 蛋心    白蛋一制放在表因        达：景步实原 原步：   因在一白  个  蛋 于是 式、脱依合特的三加的， 混模伸 引 伸如复 内 具： 以 水 聚一成 .备：特反否个关设源的同剪 的。两表在的内把 一太 的最应布碱或在出。： 减 互修任能配 此选可以身构应身结物构多补过物序连补严基，或结行酶验当设 .这。接存 经处酶操后 、酸酒 水方的量括 是 性广 外 应一酶 抑 （去过阻和性性 原： ". . " / ? 目非胶验原件泳-不能断完的泳性此要速完的即、药泳子液透，冲 冲验×胶泳凝台总于验 冲 ，孔电 电 清紫 果凝剂: （( 甘/%蓝）去电（）%放洗胶%用琼 的 糖化 其醛 和混糖备 ，如 甲 匀 再钟 匀泳 泳灯查