蓝细菌中RNaseE的C端蛋白与其他蛋白互作的研究毕业论文.doc

蓝细菌中RNaseE的C端蛋白与其他蛋白互作的研究蓝细菌中RNaseE的C端蛋白与其他蛋白互作的研究 目录摘要错误！未定义书签。Abstract2缩略语表21前言错误！未定义书签。1.1 蓝细菌21.2 鱼腥蓝细菌PCC7120错误！未定义书签。1.3 核糖核酸酶11.3.1多聚核苷酸磷酸化酶PNPase21.3.2核酸核糖酶E31.4 研究目的与意义42.实验试剂，材料，仪器和软件52.1实验中所用到的主要试剂22.2实验所用到的菌株22.3实验所用到的主要仪器23.实验方法63.1 IPTG诱导目标蛋白的表达63.1.1IPTG诱导蛋白质表达的原理73.1.2IPTG诱导蛋白质表达的实验步骤错误！未定义书签。3.2 压力破碎法从PCC7120中提取蛋白错误！未定义书签。3.3 镍柱亲和层析法分离纯化目标蛋白错误！未定义书签。3.3.1镍柱亲和层析法分离纯化蛋白的原理错误！未定义书签。3.3.2镍柱的处理错误！未定义书签。3.3.3镍柱结合蛋白错误！未定义书签。3.3.4蛋白的洗脱错误！未定义书签。3.4 SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度和含量错误！未定义书签。3.4.1安装电泳槽错误！未定义书签。3.4.2分离胶和浓缩胶的制备错误！未定义书签。3.4.3蛋白质样品的预处理错误！未定义书签。3.4.4蛋白质样品上样及电泳错误！未定义书签。3.5 dot-blot验证蛋白质的相互作用错误！未定义书签。3.5.1dot blot检测蛋白互作的原理错误！未定义书签。3.5.2dot blot检测蛋白互作的实验步骤错误！未定义书签。3.5.3预实验错误！未定义书签。4.结果与分析24.1蛋白质的纯化结果与分析错误！未定义书签。4.1.1蛋白A4396的纯化结果与分析错误！未定义书签。4.1.2蛋白4331C1-H的纯化结果与分析错误！未定义书签。4.1.3蛋白4332C2-H的纯化结果与分析错误！未定义书签。4.2dot-blot验证蛋白质相互作用的结果与分析错误！未定义书签。5.讨论错误！未定义书签。参考文献2致 谢错误！未定义书签。摘要在大肠杆菌中已被证实，mRNA降解体是以RNase E为组装支架，PNPase(核苷酸磷酸化酶)三聚体、RhlB(RNA酶解螺旋酶B)单体以及enolase(烯醇化酶)二聚体的相互作用结合共同组成的功能复合物，共同协调完成对mRNA等RNA底物的加工剪切及降解过程。降解体复合物其它几种组分PNPase、RhlB和enolase在RNase E的C端非催化区域结合位点与RNaseE结合。但是在蓝细菌中RNaseE 在mRNA降解体中发挥什么作用及其生理特性并未被证实。鱼腥蓝细菌PPC7120研究蓝细菌的模式菌株，我们以PPC7120为研究对象，分别诱导提纯了PPC7120菌株异形胞中的RNaseE的两个蛋白居于C端的A4331和A4332以及PNPase的A4396蛋白，用dot blot 的方法证明A4331是否与A4332、A4396有相互作用，为研究蓝细菌中RNaseE 在mRNA降解体中发挥的作用及其生理特性提供基础。关键词：鱼腥蓝细菌 RNaseE PNPase 蛋白诱导纯化 dot-blot AbstractIt has been formulated that the RNA degradosome of Escbericbia coli is a multiprotein complex involved in the degradation and processing of most messenger RNAs. the principal components are RNase E acting as a scaffold for the assembly of a multiprotein complex, the monosome of RNA helicaseB(RhlB) , the tripolymer of polynucleotide phosp -horylase (PNPase) and the dimer of enolase. RNaseE is a multidomain protein with an N-terminal catalytic region and a C-terminal noncatalytic region which contains sites for binding RNA and for protein-protein interactions with other components of the RNA degradosome. However ,what role does RNaseE play in the Cyanobacteria has not been certified. Anabaena.sp.PCC7120 is a model organism in studying Cyanobacteria. From heterocysts of Anabaena.sp.PCC7120. We induce and purify three proteinsA4331from C terminal of RNaseE , A4332 behind A4331 ,A4396 from PNPase. Then we use dot-blot method to verify if protein A4331 has interaction with protein A4332 and A4396 . what we have done will establish a solid foundation for the further study of the physiological characters of RNaseE in Cyanobacteria.Keywords：Anabaena.sp.PCC7120 RNaseE PNPase induce and purify protein dot-blot缩略语表缩写词英文中文RNaseRibonuclease核糖核酸酶PNPasepolynucleotide phosphorylase多聚核苷酸磷酸化酶ddH2Odoble distilled water双蒸水PBSphosphate balanced solution磷酸缓冲液IPTGIsopropyl -D-1-thiogalactopyranoside异丙基-D-硫代半乳糖苷TEMEDTetramethyl ethylenediamine四甲基乙二胺EDTAethylenediaminetetraacetic乙二胺四乙酸四钠LBLuriaBertani mediumLB 培养基ODoptical density光密度SDS-PAGEsodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳RNARibonucleic Acid核糖核酸PCC7120Anabaena.sp.PCC7120鱼腥蓝细菌1前言：1.1 蓝细菌(Cyanobacteria) 蓝细菌也称作蓝藻，是一种原核生物。它是地球上起源最早的生物种类之一，广泛的分布于地球的各个角落，即使在岩石或温泉中也能发现它们的踪迹。作为原核生物，蓝细菌没有细胞核，仅有拟核。它的核物质一般呈颗粒状或者网状分布于细胞内。蓝细菌是产氧的光合自养生物，它含有叶绿素和藻蓝素，其光合作用的部位称为类囊体。类囊体数量很多，以平行或卷曲方式贴近地分布在细胞膜附近。蓝细菌属于革兰氏阴是菌，细胞壁外层为脂多糖层，内层含有肽聚糖。大多数蓝细菌无鞭毛，但可以“滑行”。 依细胞形态差异来区分，蓝细菌包括单细胞蓝细菌和丝状体蓝细菌两大类，而丝状体蓝细菌又分为有异形胞的和没有异形胞两类。本次试验所用的鱼腥蓝细菌即为有异形胞的。内孢子链丝段、静息孢子和异形胞是蓝细菌细胞常见的特化形式。异形胞由营养细胞分化而来，它们具有固氮的功能。静息孢子是一种休眠细胞，具有抗干旱或冷冻的能力。 蓝细菌主要以二分裂或多分裂方式进行繁殖，少数蓝细菌可形成孢子，孢子壁厚，能抵抗不良环境。蓝细菌的营养需求简单，它们不需要维生素，可以硝酸盐或者氨作为氮源。它们对生活条件、营养要求都不高，只要有空气、阳光、水分和少量无机盐类，便能大量快速的生长，因此很适合作为实验用生物。1.2鱼腥蓝细菌（Anabaena.sp.）PCC7120鱼腥蓝细菌是由一列细胞构成的丝状蓝细菌，属于蓝细菌的一个属。丝状体单一或成团，细胞圆形，厚壁孢子圆筒形，无公共胶质鞘。鱼腥蓝细菌不仅具有营养细胞, 而且还具有异型胞,异形胞与营养细胞间隔排列。异形胞是在缺氮的营养条件下由营养细胞分化而来。分化之后，营养细胞主要负责进行光合作用，为异形胞提供有机养分。而异形胞负责进行固氮，为营养细胞提供固定的氮元素。因此鱼腥蓝细菌既能用于光合作用的研究, 又能用于细胞分化和固氮作用的研究, 是蓝藻中最常用的模式生物之一。1.3核糖核酸酶：1.3.1多聚核苷酸磷酸化酶PNPase多聚核苷酸磷酸化酶（ polynucleotide phosphorylase）是作为第一个RNA合成酶被发现的，属于外切核酸酶中的PDX家族，包括来自细菌的RNA酶PH和古生菌和真核生物中的外切体。该酶由pnp基因编码，由两个启动子转录，其表达是由多聚核苷酸磷酸化酶和RNA酶在转录后水平上的协调作用的消极自动调控。系生物催化剂中的转换化学功能基因的酶类，通常可从大肠杆菌(Escherichia coli)或溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)中提取分离获得。研究表明，抗生链霉菌中的PNPase的结构是同型三聚体，每一个同源体都是由四个结构域组成：形成催化位点的结构要素两个PH域，两个RNA结合域，两个PH结构域在序列和结构上是相互联系的，被认为是由一个古老的基因通过复制融合形成的。PH结构域形成一个六聚体环，环的中间通道形成催化位点，RNA结合位点在环的表面形成一个帽子结构控制RNA亚基进入催化中心并促进RNA合成。在最新的研究中，大肠杆菌中PNPase的RNA结合位点被删除了，但是这并没有影响到PNPase和RNaseE的相互作用。所以可以推断RNaseE应该与PNPase的催化位点进行相互作用。PNPase的三重对称结构暗示PNPase上应该有三个独立的位点与RNaseE相互作用(Agamemnon J. C,2007)。但对于RNaseE与PNPase之间的相互作用是否会改变PNPase的结构依旧是未知的。PNPase的作用主要是随机催化核糖核苷二磷酸聚合成为多聚核糖核苷酸的反应，并释放出磷酸。主要应用于多聚鸟苷酸(polyguanylic acid)和其他多聚核苷酸的产品合成，以及作为人工合成的mRNA的片段的工具酶之一。PNPase还参与全mRNA的降解过程，该过程在细菌以及植物和多细胞生物中相似度很高，很保守。能够持续性的催化RNA的从3'到5'方向的磷酸解,释放核苷酸5'-二磷酸(Cecilia M. A,2010)。尽管在大肠杆菌中，PNPase的降解能力能被双链RNA阻止，但是PNPase 能和其他蛋白质形成复合物使之能降解各种结构的RNA，其降解能力不再受到限制。PNPase是RNA降解体的重要组成成分。研究表明，在RNaseR和RNase失活的大肠杆菌菌株中，PNPase依旧能单独执行外切核酸酶的所有主要功能。聚核苷酸磷酸化酶(PNPase)在调节RNA进入线粒体中的作用，降低PNPase的表达则会降低RNA进入线粒体中，这样一来将会损害线粒体基因组编码RNA的过程，减小RNA后加工将会抑制维持线粒体电子传递链的蛋白质翻译,线粒体电子传递链在细胞呼吸和细胞产生能量的过程中都需要消耗氧气;降低PNPase的水平，未加工的线粒体编码RNAs就会堆积，蛋白质翻译就会被抑制,进而导致线粒体能量产生减少甚至不产生能量,最终导致细胞生长失速。1.3.2 核酸核糖酶E（RibonucleaseE）：RNaseE最早是在一种温度敏感型的突变株中被鉴定出来的，它是一种单链、非特异性但对富含A或U的序列有偏爱性的内切核酸酶。由rne基因编码，由1061个氨基酸残基组成，是细胞生长中重要的核酸内切酶，温度敏感突变失活会妨碍加工且延长批量mRNA的寿命。RNaseE在加工5SrRNA基因、16SrRNA基因、tRNAs的前体，转移mRNA及RNaseP核糖酶的组成部分M1RNA中起重要作用(Cecilia M. A,2010)。大肠杆菌的RNaseE是一个同源四聚体结构，可看做是二聚体的二聚体。RNaseE由催化结构域和结合结构域两个功能性的区域组成，氨基末端部分（第1nt第529nt）形成催化功能域，且在原核生物中是相对保守的。催化位点在结构上是与DNase相关联的。整个四聚体的结构对形成催化位点是非常重要的，这与先前生化试验中证明的单独的原聚体是没有或有很少的生物活性是一致的。RNaseE的碳端部分（第530nt第1061nt）是非催化区域，是RNA的结合位点。该结合位点形成一个特定地与RNA的5端磷酸位点相互作用口袋结构和一个允许单链RNA而禁止双链RNA进入催化位点的通道。这个结构的揭示帮助许多研究者更好的理解在先前的生物化学和遗传学研究中阐明的这个酶的其他一些特性，其中包括单链RNA进入催化位点及与RNA5端磷酸位点相互作用的作用机制。RNaseE的非催化位点包括两个RNA结合位点和三个在RNA降解体组装过程中涉及到的蛋白质结合位点。包含蛋白质结合位点的区域通常被称作支架结构，因为这是组装成RNA降解体其他成分参与组装过程的框架结构，即以RNase E为组装支架，PNPase(核苷酸磷酸化酶)三聚体、RhlB(RNA酶解螺旋酶B)单体以及enolase(烯醇化酶)二聚体的相互作用结合共同组成mRNA降解体功能复合物,共同协调完成对mRNA的降解过程（罗淼，2010）。降解体复合物其它几种组分PNPase、RhlB和enolase在RNase E的C端非催化区域结合位点与RNaseE结合。这个区域通过序列分析预测是无结构的，这个预测目前已经被研究者证明了。A片段（第565nt第582nt）在RNaseE结合到细胞质内膜中起重要作用。第601nt第700nt片段形成一个富含精氨酸片段，在试管里结合RNA，在体内mRNA的降解过程中增强RNaseE的作用。第701nt第1061nt片段形成脚手架结构便于RNaseE与降解体（一个参与mRNA衰退过程的蛋白质复合体）其他主要成分的相互作用。实验中所用到的蛋白A4331、A4332都是属于RNaseE的碳端，A4396属于PNPase。1.4实验的目的和意义：在蓝细菌中，其遗传物质是DNA，蛋白质是生命活动的承载者，RNA在蓝细菌与在真核生物中一样具有连接遗传物质和生命活动物质的纽带，如mRNA是翻译成蛋白质的模板，tRNA负责在翻译时转运氨基酸，rRNA则是蛋白质组装机器核糖体的重要成分，并且一些功能性的RNA也涉及到基因表达的调控。因此，细胞中RNA的不断降解和合成，在介导代谢（如细胞的生长和分裂）变化以及细胞对不断变化着的环境的适应方面，扮演着极其重要的角色。所以对各种RNA的加工、降解和质量控制起调控作用的RNase在蓝细菌中有重要作用，所以研究RNase对揭示蓝细菌中RNA的生命过程有重要价值。已有研究表明在大肠杆菌中，RNA降解体在加工和降解RNA中发挥重要作用，而RNaseE与PNPase都是组成RNA降解体的主要成分，RNaseE的非催化结构域中的结合位点，与RNA降解体的其他组成成分相互作用，其中包括PNPase，共同协调完成RNA加工和降解的过程( )。两者之间的相互作用在形成有生物活性的RNA降解体中扮演着重要作用。而在蓝细菌中RNaseE的C端基因序列及长度和大肠杆菌的不同，而且目前没有证实蓝细菌中RNaseE的C端是否也像大肠杆菌中一样是蛋白质的结合位点。由于鱼腥蓝细菌是研究蓝细菌的模式生物，所以我们以鱼腥蓝细菌为研究对象。本课题组在鱼腥蓝细菌中寻找到与大肠杆菌中与RNaseE相结合蛋白的同源蛋白：A1223、A4718、A4396等蛋白。本实验只研究其中三个蛋白的相互作用：先用IPTG诱导蛋白的方法诱导已导入重组质粒的大肠杆菌表达鱼腥蓝细菌PCC7120中的三个相关蛋白（RNaseE中4331C1-H，4332C2-H和PNPase中A4396）的表达，再用镍柱亲和层析法分离纯化目标蛋白，最后通过dot blot的方式验证两两蛋白互作。本实验所涉及到的三个蛋白：4331C1-H是鱼腥蓝细菌中RNaseE整个碳端部分的表达蛋白；4332C2-H则是RNaseE中C端部分除去末端富含精氨酸的区域表达的蛋白； A4396则是与大肠杆菌中PNPase同源的蛋白。根据前两个蛋白的差异及它们分别与A4396的互作结果还可以分析RNaseE的C端的精氨酸富含区域对RNase与其他蛋白的互作是否是必要的。2.1实验中所用到的主要试剂1）LB培养基（液体，Luria-Bertani）：取胰蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeastextract）5 g，NaCl 5 g，溶于 800 mL去离子水中，用NaOH溶液将 pH值调至7.5，再加去离子水至总体积1 L，于灭菌锅中 121 灭菌30 min，室温保存；2）含 kam 的LB固体培养基：将配制好的 LB固体培养基高压灭菌后冷却至 50左右，加入kam 母液至终浓度为50 ug/mL，然后倒平皿。3）10%的分离胶：蒸馏水2.7ml，30%Acr-Bis (29:1) 3.3ml，1MTris-HCl(PH8.8)3.8ml，10%的过硫酸铵100ul，10%的SDS 100ul，TEMED4ul4）浓缩胶：蒸馏水2.7ml，30%Acr-Bis 670ul，1M Tris-HCl (PH6.8)500ul，10%SDS 40ul，10%过硫酸铵40ul，TEMED4ul5）1×凝胶电泳缓冲液：50mmol/L Tris-Cl (PH6.8) 50 mmol/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油6）washing buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，55 mM imidazole，pH 87）30mM的咪唑的脱色液： 20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 30mM Imidazole(咪唑)8）50mM的咪唑的脱色液： 20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 50mM Imidazole(咪唑)9）70mM的咪唑的脱色液： 20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 70mM Imidazole(咪唑)10）100mM的咪唑的脱色液： 20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 100mM Imidazole(咪唑)11）250mM的咪唑的脱色液： 20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 250mM Imidazole(咪唑)12）考马斯亮蓝R250染色液：浓度为2.5g /L，用甲醇：醋酸：蒸馏水=5：1：5的溶液配制（V/V）。13）考马斯亮蓝脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml、加双蒸水至100ml。14）一抗：蛋白免疫兔子得到的抗血清/或经纯化过的抗体15）二抗：羊抗兔抗体16）纤维素膜封闭液：5%的脱脂牛奶17）0.01M磷酸盐缓冲液PBS（PH7.4）：取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4冰箱中。18）显色剂：2.2实验所用到的菌株1）大肠杆菌典型表达菌株：BL21（PETalr4331C2、PETalr4331C1、PETall4396）。2.3实验所用到的主要仪器1）压力破碎仪4）高速离心机5）电热恒温培养箱（37 ）6）摇床3.实验方法3.1 IPTG诱导目标蛋白质的表达3.1.1 IPTG诱导蛋白质表达的原理：E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。3.1.2 IPTG诱导蛋白质表达的实验步骤：3.1.2.1外源基因的诱导表达1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。4）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30-32培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42继续培养3 -5h；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 培养细菌数小时达到对数生长期。3.1.2.1PCC7120菌体的培养：用kam+LB培养基将菌体在37的恒温培养箱中培养过夜。3.1.2.2 alr4331和alr4332蛋白的诱导：1）将上述得到的菌液按照1%的比例，转接于kam+LB培养基中，将其放置37的摇床中培养4h，即可开始诱导目的蛋白的表达。2）取20ul的菌液，制样作为未诱导的对照。3）在培养基中加入诱导剂IPTG继续在37的摇床上培养2h。并取出20ul用于点样。3.1.2.3菌体样品电泳：取上述培养液1mL , 1000g离心，1 min，沉淀，加100 L 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。3.2压力破碎法从含重组质粒的大肠杆菌中提取蛋白1）收集菌体：用离心机在8000rpm离心3min收集菌体，弃培养基，收集菌体，加入10ml 1×washing buffer将菌体悬浮。2）破碎细胞：将压力破碎仪预热至4，将压力调至1000bar，将制备好的菌液进行破碎34次。3）收集蛋白：将离心机预热至4，将得到的混合液用离心机在8000rpm，离心20min，分离上清与沉淀，弃上清，收集沉淀。4）去除沉淀中的杂质：将得到的沉淀用1ml 1×washing buffer溶解，并转移至1.5ml的小离心管中，用离心机在13000rpm离心3min，保留沉淀，弃去上清。3.3镍柱亲和层析法分离纯化蛋白3.3.1镍柱亲和层析法分离纯化蛋白的原理：1）镍柱与蛋白结合的原理：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电，且无免疫原性，对蛋白质的分泌，折叠，功能基本上无影响.能高度亲和镍离子，用于蛋白质的亲和纯化。在结合buffer中的目的蛋白（有组氨酸标签）通过镍柱时，就会结合到填料，而没有标签的大部分杂蛋白则流过，不能结合到填料。2）洗脱的原理：一般是用咪唑溶液，竞争性的和镍填料结合，从而使目标蛋白从填料脱离，或者使用低pH缓冲液，降低蛋白与填料的亲和力，从而使蛋白脱离。3.3.2镍柱的处理：1）镍柱重生可以向镍柱中加入一个柱长体积的氯化镍，平衡柱子，再加入4个柱长体积的washing buffer为蛋白质提供合适的环境。2）或者直接清洗镍柱，分别用2ml 6M的PH值为7.0的盐酸胍，4ml的1M的咪唑，10ml的水清洗，再用2ml的盐酸胍平衡镍柱。3.3.3镍柱结合蛋白：在蛋白质样品过柱前，先要将蛋白质样品用6M的盐酸胍进行变性处理。然后直接上样，可将蛋白质样品流经镍柱3、4次。3.3.4洗脱蛋白：1）去除杂蛋白：分别用4ml的8M、6M、4M的urea，6ml2M的urea，4ml1M的urea来去除杂蛋白，再用10ml的washing buffer来洗去残余的urea；（当破碎细胞后目标蛋白在沉淀中则用urea洗去杂蛋白，若蛋白在上清中则无需用urea清洗）。2）分别用30mM、50mM、70mM、100mM、250mM的咪唑洗脱，收集洗脱液，检测蛋白质含量。3）再用1M的咪唑洗脱镍柱，除去上面的蛋白。再用10ml的蒸馏水清洗镍柱，最后加满水保存镍柱。3.4 SDS-PAGE检测蛋白质的含量：电泳原理：带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向正极。许多生物分子都带有电荷,其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质pH 及其组成混合物中各组分在电场中的泳动速度，首先和本身所带的净电荷多少、分子量大小和形状有关。一般来说，带电越多，分子量(颗粒)越小而且是球形的，则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同， 而达到分离鉴定各组分的目的。SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，向阳极移动。蛋白质分子移动速度仅取决于分子大小。当分子量在15000KD-200000KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。该方法特别适合含有多种成分且各成分的分子量相差较小的菌体蛋白的分离提纯。本实验采用SDS-PAGE电泳的不连续系统：不连续电泳含两层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液。浓缩胶：大孔径，pH6.76.8 Tris-HCl 缓冲液；分离胶：小孔径， pH8.88.9 Tris-HCl 缓冲液。3.4.1安装电泳槽：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，将封条放到两个玻璃板两侧，用夹子固定好，将其放到固定架上，将配好的琼脂糖快速均匀的流经玻璃板的三侧，封闭三侧的空隙，待凝固后用水检漏，若封闭完好可用于灌胶。3.4.2分离胶和浓缩胶的制备：1）分离胶的制备：30%丙烯酰胺5ml + 分离胶缓冲液 5ml +10%SDS 0.2ml +10%过硫酸铵 0.2ml + 蒸馏水 9.6 ml;混匀后加入8ulTEMED，立即混匀(不能有气泡)，灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生，灌至离槽沿3cm处，立即在胶面上用移液管加入几滴正丁醇来平衡液面。静置，待凝胶聚合后(约30min)，倒去上面的正丁醇，并用吸水纸吸干残余的正丁醇。2）浓缩胶的制备：30%丙烯酰胺1.32ml + 浓缩胶缓冲液 1ml +10%SDS 0.08ml +10%过硫酸铵 0.08ml + 蒸馏水 5.6 ml，混匀后加入8ulTEMED，立即混匀 (不能有气泡)，灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子(不能混入气泡)，静置，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。3.4.3蛋白质样品的预处理：取20ul蛋白质样品与4ul的溴酚蓝混匀，再放入沸水中煮5min，离心30s使离心管壁上无残留液体，即可准备点样。3.4.4蛋白质样品上样及电泳：1）上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品，先将不同的蛋白质样品分别点入前面的几个孔中，后面的孔加入BSA和标准蛋白质溶液。2）接通电源，将电压调至120V，当溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到 150V。电泳至溴酚蓝距离胶底部1-2cm处，停止电泳。3)染色脱色：培养皿中倒入染色液浸没凝胶，染色过夜，后回收染色液。在用清水冲洗掉胶上多余的染色液，倒入脱色液，至染色液颜色呈现深蓝后，重换脱色液，脱色4-5个小时。拿出蛋白胶进行检测。3.5 Dot blot验证蛋白质的相互作用3.5.1 Dot blot 原理：抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在蛋白质样品上的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。硝酸纤维素膜上的样品有待检测的目标蛋白，及要与目标蛋白相作用的蛋白作为正对照来反应一抗和二抗对结果是否会有影响。含有样品的蛋白膜经5%的脱脂牛奶封闭，再用与待检测样品相互作用的蛋白进行孵育，是之与硝酸纤维膜上的样品充分杂交。之后加上能与结合蛋白相杂交的一抗与蛋白孵育，再用可以检测一抗的二抗孵育，使之能充分与已结合上的一抗结合。这样，结合能相互作用的蛋白就能与一抗和二抗杂交，经过显色便能得出蛋白质相互作用的结果。3.5.2 实验步骤：1）点样：取1个硝酸纤维素膜，分别取1ul（1ug/ul）4331C1-H、4332C2-H的蛋白质样品及BSA点于膜上，其量因具体的蛋白互作情况而定（为减少背景信号，可做一个蛋白浓度梯度预实验找到合适蛋白量），再并排点上PNPaseA4396作为正对照、将膜风干。记录好样品顺序(可在膜的正面边缘处标记正面及名称，也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记，识别膜的正反面及方向)。2）封闭：取上面风干好的硝酸纤维素膜，用配制好的封闭液(5%的脱脂奶粉)在水平摇床上室温孵育至少一小时，以封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点，以避免下一步加入体与膜发生非特异性结合。3）洗膜：先用5mL 1×PBS淋洗或涮膜，再换上5mL 1×PBS，置于水平摇床上洗膜15min ，2×5min（或1×15min，1×10min）4）杂交：1号膜中加入600uL 5%脱脂牛奶(使其终浓度为1%)，适量目标蛋白（A4396），用1×PBS补平至3mL；2号膜不与目标蛋白（4331C1-H）孵育，直接加入等量的溶解目标蛋白的buffer，作为对照组。水平摇床上室温孵育1h。5）洗膜：先用5mL 1×PBS淋洗或涮膜，再换上5mL 1×PBS，置于水平摇床上洗膜15min ，3×5min（或1×15min，1×10min）。6）一抗杂交：向两个皿中分别加入1mL 5%脱脂牛奶，4mL 1×PBS，加入适量一抗（依其效价并且不产生杂信号为准，也可用封闭过的一抗，见四-5），水平摇床杂交1h（半小时也可）。（为减少两张膜的系统差异，建议先统一配好一抗，再分装到两个皿里）。7）洗膜：先用5mL 1×PBS淋洗或涮膜，再换上5mL 1×PBS，置于水平摇床上洗膜15min ，3×5min（或1×15min，1×10min）。8）二抗杂交：向两个皿中分别加入1mL 5%脱脂牛奶，4mL 1×PBS，加入1uL二抗（5000：1，其量依二抗效价及一抗与抗原结合效率而定，以最后能检测出来为准）9）洗膜：先用5mL 1×PBS淋洗或涮膜，再换上5mL 1×PBS，置于水平摇床上洗膜15min ，2×10min。10）显色：将膜浸于用1×PBS稀释10倍后的辣根过氧化物酶（底物为DAB）试剂显色，曝光30s，得到图片，或用pico显色液不经稀释显色。 3.5.3 预实验：1）抗体效价检测：以一定量的抗体量（例2000：1比例加入），检测抗原蛋白梯度稀释样品，以检测结果评价其效价。2）抗原特异性检测：以不产生背景信号为准（若抗体加多了也会产生杂信号，所以，在做实验时应综合考虑这两个方面，可以将两方面的检测在一张膜上实现），3）挑选背景信号较少的蛋白样品：将待选的蛋白样品点于一张膜上，封闭，用一定量的一抗（基本符合前两个条件）孵育，寻找背景信号少的蛋白样品作为互作实验样品。4）确定目的蛋白量：由于不同蛋白之间的互作强度不同，那么在膜上的蛋白与目的蛋白孵育的时候，对目的蛋白浓度的要求不一，所以我们实验时应让目的蛋白过量。如何确定用多少量的目的蛋白？可以用不同浓度目的蛋白进行孵育，最后确定一个合适浓度（同时应考虑到孵育buffer中的咪唑等离子浓度是否会影响到互作）。膜一与膜二差别越大越好。5）鉴于背景信号较强的（即膜二上的蛋白未与4331C1-H杂交，也有较强信号），可以用28a-his转BL21后经IPTG诱导获得的总蛋白封闭一抗，以减少背景信号。封闭过程：加300ug 总蛋白到1% 脱脂牛奶里，再加入1000：1的一抗（比例按效价而定），摇床上孵育1-2h。4.结果与分析4.1蛋白质纯化结果与分析：4.1.1蛋白A4396纯化结果与分析（2011.08.18）： 1 2 3 4 5 6 7 8 9图1：蛋白质A4396的纯化结果图中泳道1样品是细胞破碎后的上清液，2号是上清液过Ni柱最后1mL 流出液，3号、4号、5号、6号、7号、8号分别是30mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、70mM咪唑洗脱液、100mM咪唑洗脱液、150mM咪唑洗脱液、250mM咪唑洗脱液，9号是Marker0431。由图知：细胞破碎后上清液和过柱后流出的上清液中都含有目标蛋白并有大量的杂蛋白，且后者的目标蛋白并没有比前者的少很多，所以镍柱的结合效率不高或者大肠杆菌中该蛋白的表达量很高。从后面几个泳道的显示结果可知，70mM咪唑洗脱液洗脱