DNA粗提取和鉴定实验.doc

DNA的粗提取与鉴定实验一、实验原理DNA主要存在于细胞核DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料和用具鸡血细胞液（510ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0g/ml的柠檬酸纳溶液；质量的浓度分别为2mol/L和0015mol/L的氯化纳溶液（新教材不要求0、015的浓度了，都是用的2mol/L）；二苯胺试剂；铁架台；镊子；水浴锅；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（1000ml，一个，50ml、100 ml 、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。 三、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。四、方法步骤 提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有1-2层纱布的漏斗将血细胞液过滤至1000mL。取其滤液。溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态 。析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）经验值：需加约570mL蒸馏水，且分多次加入。将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上，滤液丢弃。将DNA的粘稠物再溶解取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，约3分钟，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入等体积的、冷却的、体积分数为 95的酒精溶液 （使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的白色丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。 DNA的鉴定取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。五、讨论两次使用蒸馏水第一次：细胞吸水胀破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步三次过滤第一次： DNA存在于滤液里 第一步第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层两次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多 第三步第二次：用冷却的95的酒精 第七步六次搅拌：第一、二、三、五、七、八步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。3 大大实实度的 时续浓溶当最解 时/ ；渐增浓 度 ， 0浓 杂种同解 除能 出与过，因中盐解除， 度低质的溶中除 溶的质除能， 溶地 到保样，烧要棒缓还搅、在向一要，八八七、三第：七 却用三第 质溶 用析 纱用滤其三和一纱用要，黏滤其二有稠液用布用使六 里在 ：四 纱留 ：一一 液存 ：过三 出物 一第 吸馏馏讨化变液中两且察后管， 热中于将后均剂苯 加支向。溶使搅玻用支其物将 液 为的质氯各管 鉴鉴 就要物种水上吸并卷丝璃用状白较含出，棒璃并佳凝 ，的冷 溶的 分体却的入中的 的质中液 ，滤液中骤斗布两放， 溶化 含中液解能可使分约拌不璃液溶至稠的子镊。0液 浓的物化杯向 0 溶物的弃液上布物粘 ，烧 溶 ，的层多稠的 绕缠着 ，匀均不沿轻，蒸贴该验实的实步一分其 中入入多馏 加 当相质钠氯溶（入停时物当多会粘出液馏蒸。色物察观出状有这，轻不用同蒸加内稠的 状呈溶 时均混， 向方璃并液入 的 为浓的钠 的核液其 0至液血漏纱层放用。加血 搅棒玻同 入加。杯 入 胞鸡物胞的细骤法液细鸡可，澄管去吸。验管心沉， 心离）（ / 用心倒将也。胞血，箱置中将凝，分溶檬柠血拌用， （鲜新杯 0， ）凝（酸柠 0度胞胞鸡。纱管；）二0（）二 、 0 0个 0；烧一 0量滴纸；锅水；架试二） 的是度的、要材（化的 0 别浓量；纳的/度；蒸 箱置实液精% 积） （用材剂试 定可二因蓝染水胺遇 的含取进，原利。酒可蛋的细，溶于 出析的液 解溶理一用度的 时 .浓质 的而化度 随是溶溶 胞于存原验