生物有机肥对烟田土壤的影响.doc

3 生物有机肥对烟田土壤的影响由于田间环境的复杂性，单独施入微生物菌剂受到外界温度，湿度，pH及优势土著微生物等条件的影响，拮抗菌定殖能力不强，不能大量繁殖形成优势群体，出现微生物菌剂在大田试验中效果不稳定的现象，本身具有的防治作用在很大程度上受到限制，不能够充分发挥。同时，由于生存在自然环境中的病原菌极易产生抗性，因此在制作生防菌剂时应该混合多种菌株，有效防止病原菌对某一种产生抗性。所以试验采用有机肥和拮抗菌剂混合二次发酵，以拮抗菌株为主，有机肥料为辅，综合使用进行防治烟草黑胫病的发生。拮抗菌在有机肥中大量繁殖后再施入田间，就可以避免单独施用肥料和拮抗菌剂所存在的问题。有机肥可以为拮抗菌提供大量的营养物料，有利于拮抗菌的定殖与繁殖，使得田间土壤中有益微生物大量增加，改善土壤的生态环境，产生多种活性物质和抗病物质，促进植物根系的发育，减少或降低作物病虫害的发生，从而能有效的防治土传病害的发生。3.1 材料和方法3.1.1 试验时间和地点田间试验于2013年在四川省凉山州烟草分公司试验基地进行。凉山烟区属于亚热带高原季风气候区，旱、雨季分明，冬半年日照充足，少雨干暖，夏半年雨量充沛，白天太阳辐射强，日照充足，光热资源丰富，均温在为16.925.6。大田生育期59月气温均在20以上，=10积温5329.9，且无霜期达到230306天。年平均降水量在50.3 mm286.5 mm，5月团棵期降水量较少，有利于促进根系发育；旺长期6、7月份，降水量在200 mm以上，利于烟株和叶片的生长，提高产量；成熟采收期8、9月降水量减少，利于烟叶正常落黄和香气物质的形成和积累71。试验基地海拔1500 m，试验地地势平坦，肥力中等，该地区多年连作，土壤轮作困难，往年黑胫病发病相对严重。3.1.2 试验材料供试烟叶品种为红花大金元(简称“红大”)，该品种不耐涝但抗旱，在移栽到现蕾期黑胫病极易发生，属于高感烟草黑胫病的品种。采用漂浮育苗法进行育苗。试验所用烟草专用基肥N:P2O5:K2O比例为1:1:3，为烟草公司提供的烤烟专用复合肥。固体拮抗菌剂的制备：分别将C13和Ty-3的拮抗菌菌悬液，与麦麸以500:1（mL/kg）的比例混合，搅拌均匀，30下培养3天。培养过程中定期搅拌，保证散热和有氧环境以供拮抗菌生长。待培养结束后，风干装袋备用。生物有机肥制备：首先将油枯进行高温发酵腐熟后，再将已固体培养的拮抗菌剂按1:30的比例加入到腐熟油枯有机肥中进行二次发酵，水分含量50%左右，在自然温度下（25左右）静止2天后，即制成了具有生物防治功能的功能性生物有机肥，经检测表明制成的生物有机肥中拮抗菌的数量均达到106 CFU/g。试验中选用的土壤调理剂为钙镁磷肥，钙镁磷肥除含有一定量的磷元素外，还含有大量钙、镁等中量元素，并且呈碱性，施入土壤后可以调节供试土壤的酸碱度，改善土壤的物理、化学和生物性质，使其更宜作物的生长。3.1.3 试验方法3.1.3.1 试验设计大田试验选取肥力相对均匀、地势平坦、以往高发黑胫病的地块为试验田，4月20日移栽。试验设置四个处理：处理施肥方式T1对照（按当地常规施肥方式和数量进行，有机肥施用腐熟油枯，30 kg/666.67 m2） T2施用土壤调理剂（在对照基础上施用土壤调理剂，100 kg/666.67 m2） T3施用生物有机肥（在对照基础上施用生物有机肥，折合油枯施用量仍为30 kg/666.67 m2） T4施用土壤调理剂和生物有机肥(在对照的基础上，施用土壤调理剂100 kg/666.67 m2和生物有机肥，折合油枯30 kg/666.67 m2) 以上肥料均为移栽时穴施。 试验依照随机区组设计，大田共计为12个小区，每处理重复3次，每小区种植170株，植株密度1100株/666.67 m2，株距行距为0.5 m×1.1 m，大田面积为1236.34 m2。日常田间管理按照优质烟栽培技术进行。3.1.3.2 根际土壤样品的采集烟叶大田生长期间，按照烟草的生育时期采集根际土壤，即移栽期，团棵期，旺长期和成熟期，依照S形5点取样法取样，将烟株与根部土壤一同取出，去除一些大块土后，将粘连于细根上 的土抖落，即为烟株根际土壤；每个小区采集五个取样点土样混匀，并将其低温保存带回实验室待测。烟草生育时期分类参考中华人民共和国烟草行业标准YC/T142-2010 烟草农艺性状调查方法进行。移栽期：烟苗达到壮苗标准，移栽大田的日期。团棵期：植株达到团棵标准，此时叶片1213片，叶片横向生长的宽度与纵向生长的高度比例约为2:1，形似半球状时为团棵期。旺长期：植株从团棵到现蕾期。成熟期：烟叶充分进行内在生理生化转化，达到了卷烟原料所要求的可加工型和可用性，烟叶质量达最佳状态的时期。3.1.3.3 土壤酸碱度的测定土壤酸碱度的测定采用电位测定法：称取过80目筛风干土样10.0 g置入小烧杯内，加入25 mL蒸馏水振荡1 min2 min，充分混匀土样，放置半小时后，用酸度计测定。3.1.3.4 土壤中微生物数量的测定土样中细菌、放线菌和真菌数量测定：称取10 g土样于装有 90 mL无菌水的三角瓶中，振荡30 min，130 r/min，然后静置15 min进行稀释，选取细菌稀释度10-410-6、放线菌稀释度10-310-5、真菌稀释度10-210-4。具体操作方法参照第二章中混合平板培养法。待长出菌落后，分别对平板中的菌落进行计数。 3.1.3.5 土壤氮磷钾含量的测定土壤氮磷钾含量的测定需将土壤风干，然后过筛（孔径为1 mm）。化学指标测定方法72如下： 土壤碱解氮的测定方法依照碱解扩散法：称取风干土样2.00 g和1 g FeSO4粉剂，均匀铺在扩散皿外室内，来回旋转扩散皿直至样品混合均匀；吸取2 mL 2%的硼酸溶液，加入扩散皿内室，滴加1滴定氮混合指示剂，在扩散皿外室边缘涂抹阿拉伯胶，盖上皿盖旋转数次，使整个扩散皿完全封闭，再缓慢旋转开皿盖露出细小缝隙，迅速加入10 mL，1.8 mol/L的NaOH溶液，再次完全封闭扩散皿。将扩散皿置于恒温箱中，保持40，24 h后取出，用0.01 mol/L的HCl标准溶液滴定内室直至溶液由蓝色至微红色。同时做空白试验，记录滴定所耗盐酸量。相关计算公式如下： （3.1） 式中 V-滴定所用去的HCl体积；V0-空白试验用去的标准HCl体积；N-标准HCl的摩尔浓度；14-一个氮原子的摩尔质量mg/mol；1000-每千克样品N的毫克数。土壤速效磷测定依照碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法：称取5.0 g土样于锥形瓶中，分别依次加入100 mL，0.5 mol/L的NaHCO3溶液和无磷活性炭，封闭瓶口振荡半小时，过滤收集滤液；吸取10 mL上述滤液于50 mL容量瓶中，加入5 mL硫酸钼锑抗混合显色剂，摇匀，排出二氧化碳后定容；静置30 min后， 比色测取吸光度（波长为660 nm）。其中磷标线的绘制：依次吸取0、1、2、3、4、5 mL浓度为5 mg/L的磷标液于50 mL容量瓶中，再依次加入10 mL，0.5 mol/L的NaHCO3和5 mL硫酸-钼锑抗混合显色剂，比色后绘制标准曲线。相关计算公式如下： （3.2） 式中 比色液浓度-从标线上得到的磷的浓度（mg/L）；W-土样质量(g)。土壤速效钾测定依照醋酸铵-火焰光度计法：取5.00 g土样于锥形瓶中，加入1 mol/L NH4OAc溶液50.0 mL，塞紧瓶塞，25振荡30 min，用滤纸过滤，收滤液；吸取滤液0.5 mL于50 mL量瓶中，加水定容至刻度。此滤液和钾标准溶液一起在火焰光度计上进行测定。其中，钾标准曲线的绘制：分别吸取100 mg/L的K标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL放入100 mL容量瓶中，用1 mol/L的NH4OAc溶液定容，即得0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/L的K标准溶液。相关计算公式如下： （3.3） 式中 待测液浓度(mg/L)-从工作曲线上查得的钾溶液的浓度； 加入浸提剂毫升数-加入的醋酸铵溶液体积。 3.2 结果与分析多数情况下，土壤微生物均处于营养缺乏的状态，田间施用生物有机肥后，有机肥料不仅能为微生物提供大量的有机能源，为其繁殖活动带来所需能量，同时也为土壤提供丰富的微生物种群与数量，某种程度起到“接种”的作用，致使土壤微生物结构上发生较大转变，而土壤中微生物数量的增加，又促进对有机肥的分解，使土壤中碱解氮、速效磷、速效钾含量增加，改善土壤肥力，影响烟草生长发育、烟叶的产量和品质73。3.2.1 根际土壤pH的变化土壤pH能改变土壤养分的存在状态、转化和有效性。对土壤中有机质的矿化作用和氮素的硝化作用都有显著影响，且作物的生长发育也有其有直接的联系。土壤pH值与有机质、碱解氮、速效磷、速效钾呈显著相关，烟草生长的pH范围是5.68.0，以67最适宜74。适当提高酸性土壤的酸碱度，有利于土壤微生物的生长和有机物的矿化。本试验土壤呈弱酸性，从图3.1中可以看出，移栽期各处理之间pH无显著差异，在同一水平；在烟株的整个生育期中，T2、T3、T4处理的pH值均有不同程度的提高，与对照间的差异达到显著水平(p>0.05)，说明施用生物有机肥和土壤调理剂均可以改善土壤酸碱度。T2，T4处理与T3处理间也表现出明显差异，说明生物有机肥和土壤调理剂配施提高烟叶土壤pH效果最好，其次是单施土壤调理剂。土壤调理剂含有活化因子可以有效改善土壤pH，因此在酸性土壤上配施生物有机肥和土壤调理剂，可以显著提高土壤的pH 值，有利于烤烟在适宜 pH值的土壤上对土壤中营养成分的吸收，从而使烤烟优质适产75。 图3.1 不同施肥处理对烟株根际土壤pH的影响Fig.3.1 Effect of different fertilization treatments on pH in rhizosphere soil3.2.2 根际土壤细菌数量的变化图3.2是烟株各生育期根际土壤细菌数量的变化。从图中可以看出，不同处理间烟株生育期内细菌数量都表现为先增加后减少的趋势，其中旺长期数量最多，成熟期细菌数量又有所下降。此种变化趋势与罗明76研究棉花生育期内土壤微生物数量的变化相一致。烟株移栽期，根际土细菌数量均较低，到了团棵期，烟株根际土壤细菌数量都有所升高。T4处理在烟株整个生育时期内细菌数量都较高，这说明施用生物有机肥既可以直接增加土壤中细菌的含量，还可以提供有机营养物质供微生物生长繁殖，从而增加土壤中微生物的含量。T2，T4处理的细菌数量在旺长期、成熟期均比T1与T3不施加土壤调理剂的处理高，其中T2，T4处理在旺长期分别比对照高出246.9%，349.0%，成熟期分别比对照高出71.4%，168.6%，差异显著；这可能因为添加土壤调理剂调节了土壤pH， 而相对较高的土壤酸碱度在一定程度上利于增加土壤中细菌的数量。 图3.2 不同施肥处理对烟株根际土壤细菌的影响Fig.3.2 Effect of different fertilization treatments on bacteria number in rhizosphere soil3.2.3 根际土壤放线菌数量的变化在烟株生育期内，不同处理间根际土壤放线菌数量变化如图3.3所示。由图中可知，团棵期至旺长期T2，T4处理中放线菌数量逐渐增加。一方面可能是施加土壤调理剂，调节了土壤pH，相对较高的pH可以促进放线菌生长；另一方面可能是随着生育期的推进，作物根系功能逐渐完善， 使得土壤的物质转化和能量循环更为顺畅，放线菌因此得到更为丰富的营养而大量繁殖。比较而言，土壤调理剂和生物有机肥配合施用的T4处理，在烟株团棵期、旺长期放线菌数量均高于T1、T2和T3处理，其中与对照相比放线菌数量分别高出了187.5%和232.0%，这主要由于生物有机肥不仅可以提供微生物生长繁殖所需的营养物质，而且还提供了大量的有益拮抗菌群，在土壤中定殖。大多数放线菌能产生丰富的抗生素，抑制土壤病原菌的繁殖，有利于烟株健康生长。因此，放线菌数量的增加对于防治烟株病害发生十分重要。生物有机肥的施用明显可以提高土壤中放线菌的数量，调节根际微生态环境，提高烤烟对病害的抵抗能力。烟草进入成熟期后，T2、T3和T4处理中根际土壤放线菌数量都有所下降，这可能是因为烟株处于生育后期以及温度、湿度等因素影响了土壤中放线菌的生长基质。 图3.3 不同施肥处理对烟草根际土壤放线菌的影响 Fig.3.3 Effect of different fertilization treatments on actinomyces number in rhizosphere soil3.2.4 根际土壤真菌数量的变化在烟株各个生育期内，不同处理间根际土壤的真菌数量也存在动态变化，如图3.4所示。由图3.4可以看出，除T1外，其余各处理真菌数量均随着烟株生育期推进，呈现先增加后减少的趋势。在旺长期内各个处理的土壤真菌数量明显增加，其中以T4处理增加尤为显著且真菌含量最高，比对照组真菌数量高出191.7%，差异显著。烟株进入成熟期，T2、T3和T4处理根际土壤中真菌数量显著下降，但仍高于移栽期真菌数量。 图3.4 不同施肥处理对烟株根际土壤真菌的影响 Fig.3.4 Effect of different fertilization treatments on fungi number in rhizosphere soil3.2.5 根际土壤碱解氮含量的变化土壤碱解氮是反映土壤氮素供应状况的重要指标。氮素可以决定烟草生长快慢，叶片大小以及产量的多少，与烟叶成分，吸味及刺激性均有密切关系。不同施肥处理土壤中碱解氮含量在烟株生长发育期间呈现先增加后降低的趋势（图3.5）。从图中可以看出，移栽后T1，T2处理碱解氮含量稍高于其他处理，这可能是由于大田生育前期施用氮肥的配比不同。团棵期T2添加土壤调理剂的处理，碱解氮含量略高于其他处理且差异显著，比对照高出21.1%。烟草旺长期T3，T4施用生物有机肥的处理碱解氮增加迅速，分别比对照高出12.5%，7.3%，与T1，T2处理差异显著，此时烟株生长代谢旺盛，土壤供氮达到高峰，生物有机肥中的有机质矿化，释放肥力，增加了碱解氮含量。烟草旺长期到成熟期，T3，T4处理碱解氮的含量略高于T1，T2处理，达到显著性差异水平，土壤碱解氮含量分别比对照处理高出19.7%、32.2%；一方面由于生物有机肥的缓冲作用，减少了外界环境条件造成的肥料损失，同时这个时期烟株对氮素的吸收量高，微生物分解代谢，促使生物有机肥中的有机质矿化，土壤释放出更多的养分，高含量的氮素有利于烟株后期氮素的积累，可以促进烟株品质、产量的提升，说明施加生物有机肥能够在烟株生长的关键时期提供充足的氮素，对烤烟土壤碱解氮有显著调节作用。成熟期 T2处理碱解氮含量明显高于对照，说明土壤调理剂可以减少氮素损失，提高了土壤氮素的保蓄能力。土壤调理剂含有活化因子，能调节微生物生长环境，使菌群数量增加，从而促进含氮有机质的分解转化，丰富可利用氮素含量，增强土壤氮素的存蓄能力，从而减少氮素损失。 图3.5 不同施肥处理对烟草根际土壤碱解氮的影响 Fig.3.5 Effect of different fertilization treatments on alkali-hydrolyzale nitrogen in rhizosphere soil3.2.6 根际土壤速效磷含量的变化磷对烤烟早期的影响大于后期，缺磷会导致烟叶生长受阻，生长缓慢，推迟开花，不正常成熟。图3.6显示了不同施肥处理烟草生育期内根际土壤速效磷含量的变化。移栽期土壤中磷元素含量普遍较低。移栽后进入团棵期，土壤速效磷的含量均有所增加，其中，T2，T4处理与对照相比增加明显，有显著性差异，分别增加了65.3%，61.4%，可能是添加的土壤调理剂调理了土壤环境，减弱了土壤固定磷的能力，增强磷的活化，提高了速效磷含量。但此时总体增长缓慢，这可能是此时烟株生长较弱，对磷需求较少的缘故。 到了烟草旺长期，土壤中磷表现为大幅增加， 烟株此时营养生长，土壤中的微生物代谢活动旺盛， 分泌的活性物质促使有机肥中的磷分解，增加了土壤中磷的含量，可促进烟株生长，有利于烟株的吸收。T2、T3、T4处理分别比对照增加了26.2%，20.3%，46.8%，其中T2、T3、T4与对照处理差异均达到显著水平，T4处理差异最显著，在旺长期释放的速效磷最多。各处理到了成熟期速效磷含量有所降低，T4比对照高出 10.3%，与其他处理达到显著性差异。从整个生育期来看，各处理的速效磷均表现出先增高后降低的趋势，且施用生物有机肥的处理土壤供磷水平高 于对照，可能是因为生物有机肥含有的有益菌对土壤磷的矿化作用和有机物对磷的络合作用，可有效提高肥料的利用率。T4处理的含量均高于其他处理，说明生物有机肥和土壤调理剂配施改善土壤有机质状况效果最好，减少了磷的固定，同时土壤微生物数量增加促进了磷酸酶的活性，提升有机磷矿化为可利用速效磷的效果。 图3.6 不同施肥处理对烟草根际土壤速效磷的影响 Fig.3.6 Effect of different fertilization treatments on available phosphorus in rhizosphere soil3.2.7 根际土壤速效钾含量的变化钾是烟叶需求营养元素最多的，有助于光合作用的生成，对烟株能力、物质代谢及烤烟品质具有重要影响。土壤中钾含量高时，土壤阳离子代换量高，不但利于土壤的保水保肥，而且可满足烟草对钾的需求，烟草的抗病性强，成熟落黄好；反之，烟草的抗病性差，品质和产量下降，土壤阳离子代换量也下降，不利于烟田土壤的保水保肥77。由图3.7中可知，在烟草生育期内，各处理土壤中速效钾含量变化趋势均表现为先增加再降低的趋势。烟草团棵期，T1，T2处理土壤速效钾增长趋势较快，与其他处理差异显著，旺长期含量达到最高。团棵期到旺长期，T3，T4处理增长速率较快，土壤速效钾含量分别比对照增加14.3%，16.8%，达到显著性差异；此时添加生物有机肥的处理微生物活性最高，能有效促进土壤中钾的释放，满足植株生长需要。各处理由烟草旺长期到成熟期，速效钾含量迅速降低，说明烟株在这个阶段经历了吸钾高峰，至烤烟成熟采收期，因烟株大量吸收，土壤的速效钾含量下降。T3，T4处理含量均高于对照组，分别增加了8.4%，21.6%。在烟株生育后期，生物有机肥处理土壤中仍保持较高的速效钾含量，为烟草生长提供了充足的钾源，烟叶中速效钾和土壤速效钾含量呈显著正相关关系，土壤中充足的速效钾含量有利于烟叶品质的提高。 图3.7 不同施肥处理对烟草根际土壤速效钾的影响Fig.3.7 Effect of different fertilization treatments on available potassium in rhizosphere soil3.3 小结在烟草生产中配施生物有机肥和土壤调理剂不仅有效增加了土壤中细菌、放线菌、真菌的数量，改变了土壤微生物区系与结构，而且通过向土壤提供有机营养、调节土壤酸碱性，还显著提高了烤烟土壤中碱解氮、速效磷、速效钾的含量，促进了土壤养分的释放。 4 生物有机肥对烟草性状和品质的影响4 生物有机肥对烟草性状和品质的影响4.1 材料和方法4.1.1 烟株田间农艺性状调查烟株打顶后，分别选取每个小区10株具有代表性的烟株，调查其农艺性状，记录烟株的株高、最大叶长、叶宽、有效叶片数及茎围；并计算烟株的叶面积及叶面积系数。其中农艺性状测量方法参考中华人民共和国烟草行业标准YC/T142-2010 烟草农艺性状调查方法进行。 株高：地表茎基处到茎部顶端的高度；茎围：自下而上第56叶位之间测量茎的周长；有效叶片数：自下而上至第一花枝处顶叶的叶数；最大叶长、叶宽：长度指叶片正面自茎叶连接处至叶尖的直线长度，宽度以叶面最宽处与主脉的垂直长度，其中在测量最大叶片的长度和宽度，不能用肉眼区分时，可测量与最大叶（包括该叶片）相邻的3个叶片，取长×宽之积最大的叶片数值。相关计算公式： （4.1） （4.2）该试验田中叶面积系数=0.6345×叶长×叶宽×单株叶数×0.11/666.67。4.1.2 烟株发病率调查在烟株发病后，对每个小区进行黑胫病发病率的调查，并记录发病等级，计算发病率和病情指数。具体参照2.1.5.2试验设计中计算方法。4.1.3 烟株品质化学指标测定烟叶成熟时按照叶位单叶采收，取烤后各个小区的中部烟叶C3F（913叶位中部叶)混合样，粉碎后过80目筛，测定烟叶养分。测定总糖、还原糖、总氮、烟碱、氯、钾值，并计算施木克值、蛋白质、糖碱比、氮碱比及钾氯比。计算公式如下： （4.3） （4.4）化学指标测定方法78如下： 还原糖测定采用苦味酸比色法：称取混匀的烟叶样品0.2 g置于消化管（25mm×200mm，35及50 mL处各有一刻度）内，加入沸水30 mL，微沸5 min（不时摇动，不使固体物沾着试管壁），冷却后加水定容至35 mL，充分振荡后用滤纸过滤。取上述待测液0.5 mL分别装入两支10 mL刻度试管中，依次加入5 g/kg的苦味酸0.3 mL和200 g/kg的Na2CO31.5 mL，一支试管于沸水浴中加热10 min，用冷水冷却2 min，另一支试管不做处理作为对照。试管内溶液都加水稀释至10 mL处混匀。用分光光度计在波长400 nm处测定吸光值。标线绘制：称取0.1000 g葡萄糖溶解定容至100 mL容量瓶中，此为1000 mg/kg标准溶液，稀释此标液后，分别吸取10、20、30、40、50 mg/kg的葡萄糖标准溶液0.5 mL于刻度试管中，同上操作进行比色；其中，不加葡萄糖溶液只加显色剂等并稀释至10 mL的溶液为空白对照，绘制标准曲线。 （4.5）式中 -查标准曲线的浓度；0.909-1分子结晶的葡萄糖换算为无结晶水葡萄糖的系数。总糖的测定采用稀盐酸水解-苦味酸比色法：烟叶样品2 g置于250 mL的三角瓶中，加入蒸馏水15 mL，再加入5:4的HCl溶液20 mL，与回流冷凝管连接，水浴加热2.5 h后，取下三角瓶滴入一滴I2-KI溶液，若显蓝色则继续加热，直至加碘液不显蓝色为止，此时淀粉已完全水解，较简单的多糖也完全水解为单糖。待溶液冷却后，过滤定容于250 mL容量瓶中。吸取50 mL上述待测液置入150 mL三角瓶中，用1 mol/L的NaOH溶液滴定至中性后（用甲基红作指示剂，溶液刚显黄色为止），进行蛋白质沉淀，再将溶液过滤到250 mL容量瓶中定容。具体测定方法同上述还原糖方法相同。 总氮的测定采用的是过氧化氢-硫酸消化法：称取混匀烟叶样品0.100 g，装入100 mL的凯氏瓶的底部，加入微量蒸馏水使之湿润后，再加入8 mL浓硫酸，混匀后，在消化炉上低温慢慢加热至冒出大量白烟时，微沸5min，取下稍微放冷，逐滴加入300 g/L H2O2约10滴，并且不断摇动，继续加热微沸10 min，取下稍微放冷，添加510滴H2O2，如此反复23次，H2O2用量依次减少到消煮液完全清亮为止。最后一次微沸5 min，以消耗尽剩余的H2O2，冷却后加入10 mL水，无耗损的移入到100 mL容量瓶中，冷却后定容，用滤纸过滤制成待测液。同时做两份空白试验。吸取该待测液5 mL，放入半微量凯氏定氮蒸馏器的内室，加入5 mL 400 g/L的NaOH使溶液呈碱性，夹紧入口处进行蒸馏，馏出液约50 mL时，用0.01 mol/L的标准硫酸滴定氨直至微红色为止，记录下标准酸消耗的体积且做空白对照。 （4.6） 式中 M和V-标准酸的摩尔浓度和净用量；0.014-1 mmol氮的克数；W-样品的质量（g）。烟碱的测定采用提取脱色法：称取30 mg烟叶样品于150 mL的三角瓶中，加入1/3勺的粉末状活性炭与40 g/kg的HCl 25 mL，振荡10 min后过滤至100 mL的容量瓶中，并多次冲洗三角瓶中残余滤液，然后定容混匀；将40 g/kg的HCl 25 mL加入到100 mL容量瓶中定容混匀，作为空白对照。将待测液置于紫外分光光度计上，空白试验为参照调零，分别测取236 nm，259 nm，282 nm处的待测液吸光度。 （4.7） 式中 W-干样重（g）；1.059-换算为重量法测定值的校正系数；34.3-烟碱的吸光系数；A259、A236、A282-在259、236、282 nm处测得的吸光度值。氯的测定采用银量法：称取烟草样品2 g于瓷坩埚中，加入50 g/kg 1:2的Na2CO3和KNO3混合液40滴；水浴加热1 h后，再缓慢加热至灰分不再燃烧，放入500电炉中灰化。将灰化物用热水溶解，过滤洗入100 mL容量瓶中定容。吸取上述待测液25 mL置于三角瓶中，用100 g/kg H2SO4和120 g/kg Na2CO3，分别调节待测液到微碱性，用酚酞指示剂滴定至微红色为止。将0.5 mL，50 g/kg的K2CrO4加入上述待测液混匀后，用标准的0.03 mol/L AgNO3滴定至有砖红色沉淀为止。记录消耗的AgNO3。 （4.8） 式中 M-硝酸银的摩尔浓度； V-滴定时消耗的硝酸银的体积； W-烟叶质量（g）； 0.0355-1 mmol氯离子的克数； 1000-换算为1000 g烟叶中氯的含量。烟叶中总钾的测定采用火焰光度计法：测定钾含量时需先将烟叶样品进行灰化，称取样品置于坩埚中加热，使之初步灰化，再将坩埚置于电炉内灼烧（温度不超过500）1小时后，冷却至室温，然后称取此灰分0.500 g溶于蒸馏水中，定容至50 mL容量瓶中，制成钾待测液，吸取此待测液2 mL于100 mL容量瓶中定容，直接在火焰光度计上测定，记录检流计度数，然后从标准曲线上查得待测液的钾浓度（mg/kg）。 （4.9） 式中-从工作曲线中得出溶液中K的mg/kg值；分取倍数-待测液体积/测读液体积；106-将µg换算成g的系数。4.2 结果与分析4.2.1 不同施肥处理对烟株农艺性状的影响株高在一定程度上可以反映烤烟代谢的强弱。株高增加，叶片数、茎围也会增加，是烟株生长内在协同性强弱的外在体现。表4.1 为不同处理下烟株的农艺性状，可以看出各个处理对烟株的农艺性状影响不同，总体来说，施加生物有机肥对烟株的生长发育起着积极的作用。从株高来说，与对照相比，T2，T3和T4处理中烟株 株高分别高出了7.0%、10.3%和13.6%，说明施加土壤调理剂和生物有机肥都可以促进烟株的生长发育，且二者配施的效果最好。 从烟株的茎围和有效叶片数来看，T3和T4处理均优于对照组T1处理，有效叶片数分别高出了9.4%和10.2%，茎围均高出了5.2%，生物有机肥能够增加茎围，扩展有效叶片数，这对烟叶产量的提高起着重要的作用。从烟株的叶长和叶宽来看，T2、T3和T4处理均比T1高，说明施加生物有机肥和土壤调理剂均能够扩展叶片长度和宽度，利于烟叶叶面积的扩展，提高产量。烤烟田间叶面积系数是衡量烟叶优劣的重要指标。在一定范围内，随着烤烟叶面积系数的增大，产量也随之提高。 表4.1中看出，T2、T3和T4处理的叶面积分别比对照高出了7.8%、23.0%和23.1%。从叶面积系数来看，施加生物有机肥的T3和T4处理与T1和T2处理之间差异显著，其中T3、T4处理叶面积系数分别比T1高出了 34.7%和35.8%。表4.1 不同施肥处理对烟草农艺性状的影响Table 4.1 Effect of different fertilization treatments on the agronomic traits of tobacco处理株高(cm)有效叶片数茎围(cm)最大叶长(cm)最大叶宽(cm)叶面积(cm2)叶面积系数T197.97a 12.7ab9.10a59.53a24.17b918.06b1.93bT2104.80a12.1b9.00a59.80a 26.07ab989.22b1.98bT3108.10a13.9a9.58a63.23a28.13a1129.66a2.60aT4111.30a14.0a9.57a64.43a 27.63ab1130.55a2.62a4.2.2 不同施肥处理对烟株黑胫病发病的影响不同处理间烟株黑胫病的发病情况如表4.2所示。表4.2中，施加生物有机肥的T3和T4处理黑胫病发病率明显低于T1和T2处理，且差异显著，防控效果分别达到67.2%和74.5%。T2处理黑胫病发病率低于T1处理，未表现出显著性差异，防控效果达到14.5%。由此可见，生物有机肥和土壤调理剂都有利于黑胫病发病率的降低，且施用生物有机肥的处理防控效果最佳。生物有机肥和土壤调理剂二者配施比单独施用黑胫病的防控效果显著。在四川凉山州烟草种植区，由于常常连作种植会导致烟草黑胫病和青枯病的混合发生。因此，发病期间也调查了烟草青枯病的发病状况 （表4.2）。施用生物有机肥的T3，T4处理青枯病发病率与对照相比有所降低，防控效果分别达到55.6%和40.7%。本试验中的生物有机肥由黑胫病生防菌剂制成，当大量的生防菌剂施入烟株根际土壤后，会对土壤中微生物群落多样性和数量产生影响，进而改变土壤生态系统的平衡和土壤肥力，对植株的抗病能力产生影响79。从青枯病的发病情况调查结果来看，不同施肥处理均对烟草青枯病的发病 率有一定的影响，其中单施生物有机肥的T3处理青枯病发病率最低，且防控效果达到55.6%，但发病率各处理间差异性不显著。表4.2 不同施肥处理间烟草黑胫病和青枯病发病情况Table 4.2 The incidence of different fertilization treatments on tobacco black shank and bacterial wilt处理黑胫病青枯病病情指数发病率(%)防控效果(%)病情指数发病率(%)防控效果(%)T12.55.5a-1.32.7a-T22.24.7a14.51.02.2a18.5T31.01.8b67.20.31.2a55.6T40.61.4b74.50.41.6a40.74.2.3 不同施肥处理对烤烟化学成分的影响烟叶的主要化学成分在很大程度上决定着烟叶的品质好坏。烟叶的糖分对其外观质量有着重要影响，在一定范围内，含糖量越高烟叶品质越好，含糖量一般在20%25%最佳。若烤后烟叶中含糖量过高，则烟气酸碱平衡遭到破坏，烟味刺激性重。表4.3中，T2、T3、T4处理的总糖含量均高于T1对照组含量，分别高出了12.5%、15.3%和26.0%。说明施加生物有机肥和土壤调理剂在一定程度上均可以提高烟叶中总糖的含量，二者配施效果最佳。烤烟生长前期氮素代谢旺盛，为后期碳的代谢转化提供基础，碳固定和代谢的增强可以促进植株体内糖的增加，从而有利于烟叶内含物充实，烟叶产量增加，品质改善。还原糖是总糖的主要成分，主要包括葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等。烤烟的还原糖含量在5%25%之间，以18%24