PK法提全血DNA步骤.doc

PK法提全血DNA（蛋白酶K法）一、试验原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。,二、步骤： 1、1ml EDTANa2抗凝血于10ml离心管中，加3体积1×RBC裂解液混匀，冰浴30min.2、4度10000 rpm离心10min,弃上清，加入1ml 1×细胞核裂解液（混匀，把沉淀摇起来），再加2ml 1×细胞核裂解液和150µl 20%SDS摇匀，直至出现粘稠透明状，加20µl 16mg/mlPK,摇匀，37度消化6h以上或者过夜（摇床160r/min）.3、加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温10000rpm 10min.4、用去头的吸头小心将上清液移至另一离心管中（宁少勿多），加等体积（吸下层）酚/氯仿（1:1 V/V）混匀，4度10000rpm 10min.5、小心移上清液，若上清液不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。6、将上清液移入另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA，10000rpm 10min.7、去掉大部分上清，摇匀，将DNA转到EP管中，12000rpm 10min.8、去上清，用70%乙醇洗（加1ml, 12000rpm 10min）2次.9、室温干燥5min，再将DNA溶于50µl 1×TE中。（TE溶解4度可存放一年，若需长期保存，则需加2倍体积无水乙醇70度保存）注：1、20%SDS用之前应先放到水溶锅溶解沉淀2、饱和酚是用Tris饱和的，Tris碱和HCL混合得TrisHCL，pH在8.0左右，可用来调pH.3、酚/氯仿（1:1 V/V）混合液分两层，应吸下层氯仿。试剂配方：10×RBC裂解液: NH4Cl 8.29g KHCO3 1.0g EDTA 0.037g 加ddH2O至100ml高压灭菌，4度保存1×细胞核裂解液: 2Mol TrisHCL Ph 8.2 0.5ml 4Mol NaCl 10ml 2mMol EDTA 0.4ml 加ddH2O至100ml高压灭菌，4度保存10×TE（Tris-HCl-EDTA）: Tris-HCl(pH 8.0) 1mol/L 100mlEDTA 1mmol 500mmol/L 20ml加蒸馏水至1L，高压灭菌，室温保存2 保（室菌， 法 / 0 0 / - ） （ 保， 0至 . . 液核保保 0至 加 0 0. . 液裂 方仿氯吸两合 :氯/ 可右. 合 碱 和 和沉溶水先前 注存存 乙积加，期需一可 中× 0溶将 温次） 0 （洗0清 0 转 ，上掉 0 状，乙无入中管入清上次一仿体则透不上液移 0度匀混/:氯/层积等）（管另液上心吸 0温匀轻和饱） / 床者以 消，, µ加状粘至摇 %µ 解裂细 再，淀把匀裂核 ，弃 离 0 冰解裂 体，心0于抗 ：。 溶 ，空真中 醇用 ， 下 0 水积倍溶 的酚中溶除离有水有作仿白蛋去除的氯酚间于质，中上在 机(管溶有离性，遭定种质白存溶当体定形中入利能质，化成形并合进容团水表分。溶溶，易 来中蛋 ，降蛋，肽肽白化在 酶在解膜钠基二 白，提，的白用是 仿酚理原