SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。一、原理      聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDSPAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDSPAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDSPAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。1样品的浓缩效应   在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(TrisGly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(TrisHCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(TrisHCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl，两槽中的Gly (pI6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。2分子筛效应   蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。二、注意事项1. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。2. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。3. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。4. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。5. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。步骤：将已清洗干净的两块玻璃板组装好，浅玻璃板朝外，固定结实，检查是否漏水；根据蛋白质分子量确定下层胶浓度，配置下层胶，在小烧杯中摇匀，沿着玻璃板之间缝隙处，缓慢灌胶，到距前玻璃板上沿1.5cm处为止，浇灌去离子水封闭空气，促进凝胶聚合，等待约1530min，交界面有明显的折光线，且倾斜模具，交界面不随之改变，为凝胶凝固良好；配浓缩胶，混匀，灌胶，插上齿梳，确保无气泡，等待凝胶完全聚合（约30min）；小心拔出梳子，将玻璃板固定在电泳架上（浅玻璃板朝内），将整个电泳架放入电泳槽，在内外槽中倒入5×电泳缓冲液，内槽液面过前玻璃板；蛋白样品加入100l 2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水中加热10min，使蛋白完全变性，取7-8l样品上样，蛋白Marker5l上样；连接好正负极导线，电流20毫安，过半换35毫安，至溴酚蓝到达分离胶底部。剥胶，将凝胶放入考马斯亮蓝染液浸泡，微波加热1min，摇5min，再加热1min,摇5min，染色液倒回，去离子水洗胶，微波加热20min脱色，清水冲两遍，观察蛋白电泳情况。3酰况泳胶电电，冲， 加，水离，染 摇 ， ， 热微液亮马放部底离蓝至毫换， ，导样上 样样 取变全使 中匀，冲 - 入品板璃面槽，电 槽在泳放电将）朝玻架在璃将梳） 约完待泡保梳插灌混胶好固凝，随界具斜，的有交， 等合进气闭水浇止 上前，慢处间之沿摇中小下，胶定子白水否查实，板浅，组块干洗骤起起 能，现清带染现中电.。量对该能）基大有蛋异或荷如质蛋 。分链单基们是定电凝酰 ，蛋这于。单或成解的 乙在，的酶乳胰肽条或红（由质 信完不误首量定 - 。 次线准这利 线 准同， 子相蛋，法胶酰 聚 由.不结 ，超不 白，蛋 进即成质完的善质与 项注开互白的不应的子于，的相电同度阻时，质的质对不小一孔离动小分，环梯 的较一白，不压电，白超的 ，项。急迁影到质蛋度胶时；应离成解 0 常泳( 于由很件后离子蛋 效分率分的于有一浓间、，胶入质果，加 白致续连度成形过这最梯区域陡梯低电成后在因离超 由)随最负 ，为其离先最速动移时电些。出离白蛋，的 离部少)= 0.( 的，离乎 的统缓条这相)孔(的，. 液胶) ， 缓浓 槽、，统续在 的品成所理等和  液的两两体指续不。系不垂采。统不续状板盘分 带白条只后 那质结具亚量有含白结种有纯样白定果程化离白蛋用，的而以小去素差质时泳可 。 （电凝聚 称方电。的而影状分荷受率的泳在 -蛋，。荷然子蛋各掩的身过远荷负白物成结质例定并，键质蛋能面表一 带条分就，样蛋质一同品化离如区成分将迁不产的子异荷所质蛋据电胺丙。行持此，的构状具联交，作催 简酰基甲，剂 简胺烯胶胺丙