SDS-PAGE法测定蛋白质分子量实验.doc

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的：1. 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。2. 学习并掌握SDSPAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfatc）是一种很强的阴离子表面活性剂 ，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS一 蛋白质复合物。SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4:1, 由于这种高密度的结合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响；SDS-蛋白质复合物具有均一的电荷密度、相同的荷质比。据流体力学等方面的研究推测，SDS-蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴恒定，与蛋白质种类无关，棒长轴变化，与蛋白质分子量成正比。SDS和蛋白质结合后所形成的SDS-蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳迁移率的影响。根据上面的分析，SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移率仅取决于蛋白质分子量的大小，因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋白质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量。朱广廉与杨中汉, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量. 植物生理学通讯, 1982(02): 第43-47页.2. 当蛋白质的分子量在15kb200kb之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： log Mr = K b*mR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。3. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide ,Acr）和交联剂NN-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide ,Bis）以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵（ammonium persulfate , APS）和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶通过浓缩效应、分子筛效应和电荷效应来分离不同分子量的蛋白质。课件2013实验二GPT活性检测&PAGE-L22013.5.15，第21页4. 浓缩胶的作用（浓缩效应）：浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而电泳液（PH8.3）中的甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移，样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩，并在分离胶前沿积累；分离胶的作用（分子筛和电荷效应）：在PH8.8分离胶中，甘氨酸离子化，迁移率超过蛋白质，穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后泳动。SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来，在电位和PH值均匀的区段泳动，依Mr大小得到分离。课件2013实验二GPT活性检测&PAGE-L22013.5.15，第24页仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100l微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.51mg/ml样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。试剂：（1） 分离胶缓冲液（3 mol Tris-HCl缓冲液 PH8.8）:取36.3 g Tris溶于40 ml 1 mol HCl，调节PH至8.8，加入蒸馏水至100ml, 保存于4冰箱中。 （2） 浓缩胶缓冲液（0.5 mol Tris-HCl缓冲液 PH6.8）:取6g Tris溶于40 ml 1 mol HCl，调节PH至6.8，加入蒸馏水至100ml, 保存于4冰箱中。（3） 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N-甲撑双丙烯酰胺（Bis）0.8g于100ml蒸馏水中加热溶解，过滤后置棕色试剂瓶中，4保存。（4） 10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g于100ml蒸馏水中加热溶解，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。（5） 10%SDS溶液：SDS可用去离子水配成10%（W/V）储存液保存于室温。（6） 1%TEMED：原液使用，储存于棕色瓶中，4冰箱中保存。（7） 10%过硫酸铵（AP）：10%（W/V）过硫酸铵现用现配。（8） 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:0.25mol Tris（三羟甲基氨基甲烷，MW 121）,0.5% SDS，1.92mol Gly（甘氨酸，MW 75），用1 mol HCl调节PH至8.3，临用前稀释5倍。（9） SDS电泳样品缓冲液：50mmol Tris-HCl（PH 6.8）；5%巯基乙醇；2% SDS；0.1%溴酚蓝；10%甘油。（10） 染色液：320 ml 甲醇+630 ml H2O+70 ml冰醋酸混匀后加入Triton X-100 2.5ml，上述溶液在水浴中加热至60后，加入考马斯亮蓝R250 1.38mg，搅拌至完全溶解，室温保存。（11） 脱色液I：280ml乙醇+630ml H2O+70ml冰醋酸混匀后加入Triton X-100 20ml搅拌至完全溶解，室温保存。（12） 脱色液II：300ml乙醇+630ml H2O+70ml冰醋酸，室温保存。（13） 琼脂糖封口胶：取2g 琼脂糖加入到100ml PH8.3 的电极缓冲液中，沸水浴中加热至琼脂糖完全溶解待用。平时保存于4冰箱中。（14） 上述实验用蒸馏水均为去离子双蒸水。 费正编，生物化学与分子生物学实验指导复旦大学出版社，第76页实验步骤1安装夹心式垂直板电泳槽：根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。2配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分离胶缓冲液 （pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis）-3.0浓缩胶缓冲液 （pH6.8 Tris-HCl）-1.2510% SDS 0.200.20 0.20 0.20 0.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸馏水 11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.10 0.10 0.10 0.05常用浓度浓缩胶、分离胶配方费正编，生物化学与分子生物学实验指导复旦大学出版社，第78页3制备凝胶板：（1）分离胶灌制：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约34mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2）浓缩胶灌制：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 4样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL，沸水浴加热35min，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。 一般加样体积为1015L（即210g蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。5电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至1520mA。待样品进入分离胶时，将电流调至3040 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。6染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。7. 计算1.相对迁移率mR =样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。注意事项 1. 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。 2有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。3. 点样量和点样体积对结果的影响: 朱广廉等曾用 5 50 微克的点样量、10 100 微升的点样体积进行比较，由于该系统有较好的浓缩效应，上述点样范围对测量结果没有明显的影响，但以10微克的点样量最好，区带窄且清楚，便于测量和照像记录。另外 , 和点样体积有关的是溴酚蓝的含量，若点样体积小，样品液中溴酚蓝的含量应适当地增加；反之，溴酚蓝的含量应适当的降低，否则，溴酚蓝区带或者模糊不清，或者太宽，影响实验的结果。4. 凝胶浓度的影响：按照表选择分离胶的浓度能得到较满意的结果。若胶浓度太低，小分子的蛋白质会跑到溴酚蓝的前面，如用7.5 % 的分离胶，核糖核酸酶就可以与溴酚蓝带混在一起，7% 以下的分离胶，核糖核酸酶将走到溴酚蓝带的前面，影响实验的结果。若分离胶过浓，大分子的样品泳动很慢、迁移率很小，且分子量和迁移率之间的线性关系变坏、实验误差增大。 5. 温度对电泳的影响：实验中观察到，在13 以下进行制胶和电泳，会发生SDS的沉淀现象，凝胶和电极缓冲液呈混浊不透明状态，电泳时间延长、电泳迁移率有所降低，影响结果的重复性，朱广廉等认为实验应在13 以上进行。朱广廉与杨中汉, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量. 植物生理学通讯, 1982(02): 第43-47页.参考文献：1 朱广廉与杨中汉, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量. 植物生理学通讯, 1982(02): 第43-47页.2 Zilberstein, G., et al., SDS-PAGE Focusing: Preparative Aspects. Analytical Chemistry, 2007. 79(22): p. 8624-8630.3 孔毅, 吴梧桐与吴如金, 蛋白质分子量测定方法比较研究. 分析仪器, 2003(02): 第44-47页.4 课件2013实验二GPT活性检测&PAGE-L22013.5.15 5 费正编，生物化学与分子生物学实验指导复旦大学出版社7 电版学旦定导实生分生对 分 质 性活二 页 第0 ,分.法测子质金吴梧00- .)( 0 , . : , 页 :0 通生物子质定泳凝酰聚 汉与献页页 ) ,理植子质蛋泳胶烯- 汉与. 第: 讯理物 的质法胶酰烯 ,杨广朱上 验认广，重影降率泳、间泳明不混缓胶象淀 发泳胶行以 观中响泳度 大差实变系线率量分很移很泳子分过若果验，前酚走酶核离下以起混酚以就糖，分 .如的溴跑蛋子低浓若的意到的离选：响浓果结响宽或不者带溴则低当含蓝，加地量蓝中样小点，蓝酚关体和,录记和，楚带最点微以响影有量对范上效的统该较进样升000样的0用廉朱响结体点点照参结的凝 与的中分子测法其还资更得为的整不量的条或们是的胶凝 蛋类对此肽单离，的基巯在它组）乳如上条蛋如基是蛋多。验，子样未法两用，。0,果的电胶 ，, 子的响正有盖不，的常合尽因，量带它 如等蛋白构及）些（蛋基大质的异常荷包靠不分测方质些发量其法胶 用能的有不项量分出线从移相品根曲准得作相数的质标 （移染 离移= 移计离的胶与取分用晰带到直液用数漂用左 ，培入脱脱色中养移胶，为切端，去玻将轻，板，定。电零回将，底料蓝 0流电离分样 0至调将开开电流电泳泳即样加内凹所底品胶到缓通心器微。样可稀如）蛋0 为样加合聚稳消 中水前用期如液理用室冷 加沸 .浓溶解用白测加理。加备即 0短应，下倒冲甘 将，余槽样滤用板样心固胶 0放，凝 0泡入，胶入槽品，处 缘璃短直胶分合胶浓头细匀缩 0配：胶分分多纸再馏封去聚胶凝线同射折层胶， 0封进高 慢壁板沿蒸少器 ， ，的板、加液滴细匀胶% 0配表灌离板板备 ，大旦导实生学编页 ，学复指验子与物编方、胶0000 0抽器干， 水00000 000 液缓. . 液液 - 液冲0 0 - 液贮 0 用试需缩 /试各离分同0名胶浓离分下统系 - 验本胶分择围量白所根胶璃的灌接勿净都、胶装注要行要型具：电直心装步 版学旦指学分化物正页 ，出复导学子与生编费水蒸去水用中冰于存用解糖至加水，缓 糖 取口封存存室冰 + 0 存存解溶拌00 入加酸 + 醇0 存保，全搅 斯入后 至中液述 . 加混醋 0+ 油油 溴 基%） （ - 冲样倍释用 至节 ，） 酸（ . .） 甲氨三 .） 液酸- （配现酸） %） 硫存保箱中棕存使： 温室存存 0配子可 溶 存贮 试色过溶加蒸 于. 液存保，试棕过溶中馏 于.）（烯丙甲 0 酰丙相体法方贮分中箱 保 0水蒸. 溶 取. 液 .冲。箱保 0水蒸 节 0 : 冲 缓剂液准蛋混也准标单制可液样 .蛋种质标量等管常管烧色锅水玻射微 或 压流；型试试原 第， 测 二 0页 ， - 测性 实0件。离大依动的值和在来解度电从多 泳子随肽积穿质超迁子离，离 在应荷子（胶；沿胶并缩样之子离导品，白中样它的较电低是界的界在随成子氨中 （电界先界成子中缩应浓（缩 ，. 检活二验0页 .0 &活 验 件。白量不离荷应子应浓胶胺丙。构网联合用 剂 铵硫在的:） - 丙双剂和） 单由凝酰量分求曲在率迁的泳进条同蛋未准条可作对量率质准的知已数 一条率相 斜；常量的白 * = ：方下，关值量与迁，之0 量分质页 - 0 通学 子的蛋法胶烯丙 ,与.页-第 ,理生 分蛋法胶胺烯 中广。分质知测率的质量分和的分较通可小量子白仅移其合结 ，的据响率泳对状形白于除物质蛋 的所白 。比量白与长，种蛋，短，状棒椭密合白-，推面等据质的度荷一具质- ；率泳不电带白于由消的有原质同低地极从电的分蛋远荷的新结密于由:为比其的高结蛋 合蛋一荷带牢成合疏子质水以 活子阴很一 ，酸十 系酰丙。多所以小于要率分质各合混法泳凝丙钠硫十即电 原术的分质蛋法 掌习术作理基法板 -了的