RNA甲醛变性凝胶电泳.doc

RNA甲醛变性胶电泳提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。一、试剂：DEPC（Sigma公司产品），MOPs（Bocherigmer公司产品），甲酰胺（Formamide，Sigma公司产品），溴酚蓝（Bromphenol Blue，Sigma公司产品）。EDTA-Na2，氢氧化钠，醋酸钠，甲醛，甘油，分析纯，国产。二、试剂配制：1、DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2L，在通风橱中，加入2ml DEPC到2升去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20min。2、10 × FA Buffer（formaldehyde agarose buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA）：配制500ml，称取3.4g NaAC3H2O放入1000ml烧杯中，加入400ml DEPC 处理过的去离子水，加入搅拌子，放在磁力搅拌器上溶解。然后加入20.9g MOPs，放在磁力搅拌器上溶解。再加1.86g EDTA二水二钠，放在磁力搅拌器上溶解。用1M灭过菌的NaOH 调PH至7.0（约用NaOH 40ml），用DEPC 处理过的去离子水定容至500ml，装入棕色瓶中，写好标签，室温避光保存。4、5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）： 配制10ml。预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：4.0ml 10 × FA buffer3.1ml 甲酰胺2.0ml 100%的甘油720ul 37%的甲醛80ul0.5M的 EDTA （PH 8.0）16ul 水饱和的溴酚蓝100ul DEPC水混匀，分装，-20保存，常用放4保存。5、1×甲醛变性胶电泳缓冲液（1×running buffer）：20 ml 10×FA gel buffer，4.0 ml 37%的甲醛，176 ml水，放入电泳槽中使用，一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。6、1.2%的甲醛变性胶：称0.4克琼脂糖，加入3.34 ml 10×FA gel buffer，加入30 ml DEPC水，微波炉融化，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约50-60，再加入600 l甲醛，倒入7.5×5.0 cm的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子，室温放置约30min后即可使用。三、实验方法一般取0.3 g的总RNA，加入1/5体积的5×加样缓冲液，65加热5 min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭（EtBr，浓度1.0 mg/mL），而不在胶中加EtBr，这样电泳后的背景较低。配好的1.2%的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30min。图1是我们实验室用以上方法检测酵母总RNA的电泳图。图1 酵母total RNA的甲醛变性胶电泳。1，酵母total RNA（0.3 g）；2，酵母total RNA（0.5 g）；3，RNA Marker（0.2 g）。RNA的质量判断标准是有清晰的26S，18S条带，无降解，且肉眼观察26S条带亮度约是18S的1-2倍。2胶 电倍- 是约 肉，无 清是判的 . ； 0 ， . 酵。胶醛 母图电 测方室们是。0电下电 - 。 中缓胶变甲胶醛% 好低的泳这 中不，/ .， 锭化 入中 前议。级 消冷冰 ，缓×积/入，的 方方用用 0 放梳宽长适插模 ， 0加再-0却浮悬察眼化波水 0入 × .加脂 ：性甲 液冲泳需结次般用使入放 甲的 0， 0 ： （冲胶甲存保放常0 ， 0 溴和 0.（ 一 0据 甲 的 油胶%0 .来 剂况状 反泳的泳电行性醛此，级易 由质 判 0分下加次管（灭 。蓝 和即层司，剩溴底，离， 荡 分， ，酚 约入 管 ：司蓝的品制先， 胺 （ 液加醛 存存 避标写中装公 0定品子过， 酚 约 . 菌灭用 上搅磁钠 水 ， 解器 搅公放 .） 。溶搅 在 子入加 离理 氢 0入烧醋00 ， 醛 甘取 分： 的 国，产 0， 的 ： ×0 0灭，盖将。灭 荡中摇然，速。 .终中离到 ，橱，子去筒理水 制剂