植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合ppt课件.ppt

陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5第第 七七 章章植物原生质体培养及细胞融合植物原生质体培养及细胞融合陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5本章内容提要：本章内容提要：原生质体培养的发展与意义原生质体培养的发展与意义原生质体的分离原生质体的分离原生质体的培养原生质体的培养植物细胞的融合植物细胞的融合体细胞杂种鉴定方法体细胞杂种鉴定方法陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5什么是原生质体什么是原生质体（Protoplast）？ 1880, Hanstein1880, Hanstein：质壁：质壁分离时，能够与细胞壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质分开的那部分细胞物质 含义：含义：去掉细胞壁的去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞力的裸露细胞。 Protoplast陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5细细 胞胞陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5微微 丝丝叶绿体叶绿体线粒体线粒体质质 膜膜液液 泡泡细胞核细胞核内质网内质网微微 管管细胞壁细胞壁高尔基体高尔基体植物细胞模式图植物细胞模式图细胞壁主要成分：细胞壁主要成分：纤维素纤维素25-50%25-50%、半纤维素、半纤维素53%53%和果胶和果胶5%5%陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5一、发展简史及其意义一、发展简史及其意义1 1、发展史发展史v18921892年：年：KlerckerKlercker机械法机械法( (利刃利刃) )分离原生质体；分离原生质体；v19601960年：年：英国诺丁汉大学英国诺丁汉大学Cocking Cocking 教授率先利用真菌教授率先利用真菌 纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；根细胞原生质体；v19681968年：年：纤维素酶和果胶酶投入市场；纤维素酶和果胶酶投入市场；v19681968年：年：TakebeTakebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。草叶肉原生质体，两步法和一步法。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5v19711971年：年：TakebeTakebe培养烟草叶肉原生质体，首次培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。获得再生植株。 v19861986年：年：SpangenbergSpangenberg对单个原生质体培养获得对单个原生质体培养获得成功。成功。v19931993年：年：有有4949个科、个科、146146个属的个属的320320多种植物，多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。主要是农作经原生质体培养得到了再生植株。主要是农作物和经济植物，如大豆、棉花、油菜、水稻、物和经济植物，如大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、苹果、马铃薯、胡萝卜等；玉米、柑桔、苹果、马铃薯、胡萝卜等；陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52 2、原生质体培养的意义、原生质体培养的意义（1 1）为细胞融合奠定基础）为细胞融合奠定基础 克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5（2 2）是遗传工程的理想受体）是遗传工程的理想受体 能够直接摄取外源能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。，细胞器甚至微生物。Isolated protoplast are capable of ingesting foreign material into the cytoplasm. This material includes the introduction of nuclear, chloroplasts, mitochondria, DNA, plasmids, bacteria and viruses. 原生质体也具有全能性原生质体也具有全能性原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点。动态的结合点。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5（3 3）理论研究）理论研究细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。生长和分化等生命活动。必须指出：必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。能继续发育。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5二、原生质体分离二、原生质体分离（一）（一） 分离方法分离方法机械法：机械法：利刃机械切割利刃机械切割酶解法：酶解法：果胶酶和纤维素酶处理果胶酶和纤维素酶处理陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51、机械分离机械分离（Machanical isolation） Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell. In practice this technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the protoplasts are eliminated. 高度液泡化的细胞高度液泡化的细胞陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52、 酶解分离酶解分离（Enzymatic isolation）双子叶双子叶外植体外植体/培养培养细胞细胞 单子叶单子叶植物胚植物胚性细胞性细胞2.1 2.1 材料材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂, ,因此常采用因此常采用悬浮细胞悬浮细胞作作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。细胞。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52.2 酶的种类和浓度酶的种类和浓度纤维素酶（纤维素酶（CellulaseCellulase） OnozukaOnozuka R-10 R-10果胶酶（果胶酶（PectolyasePectolyase）Y-23Y-23半纤维素酶（半纤维素酶（HemicellulaseHemicellulase）对幼叶来说，酶浓度较低：对幼叶来说，酶浓度较低：0.50.5-1-1纤维素酶，果胶酶纤维素酶，果胶酶(0.2(0.2-0.5-0.5);); 酶量少酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1 1或或2 2。酶量大酶量大酶液酶液PH值：值：5.4-5.8因为因为PH高，酶活性低；高，酶活性低；PH低，原生质体损坏多低，原生质体损坏多陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52.3 酶液渗透压酶液渗透压裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。用。常用稳定剂是常用稳定剂是糖醇系统，糖醇系统，如：甘露醇、山梨醇、葡萄如：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。糖、蔗糖等。目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持维持渗透浓度。渗透浓度。浓度一般为浓度一般为0.4-0.8 mol/L0.4-0.8 mol/L。而。而蔗糖等易被蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52.4 2.4 材料预处理材料预处理 ( (暗处理，预培养和低温处理暗处理，预培养和低温处理) )在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞使细胞预质壁分离预质壁分离约一小时后再用酶液处理。约一小时后再用酶液处理。原因：原因：预质壁分离可使预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露胞壁内表层充分暴露，增加胞，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低降低原原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，胞内，降低降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。感，提高原生质体的稳定性和存活率。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52.6 2.6 其它其它酶液中加入葡聚糖硫酸钾、酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaClCaCl2 2等盐类等盐类 保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力2.5 2.5 酶解处理的条件酶解处理的条件光：光：一般黑暗下静止进行；一般黑暗下静止进行；温度：温度：2525，兼顾原生质体及酶活性；，兼顾原生质体及酶活性；时间：时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般性，一般2424小时。如烟草叶片酶处理小时。如烟草叶片酶处理2 2小时后叶肉细小时后叶肉细胞解离完毕。胞解离完毕。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52.7 原生质体分离过程原生质体分离过程 （一步法（一步法以烟草叶片为例）以烟草叶片为例） 第一步：第一步：预处理即对烟草植株限制供水。预处理即对烟草植株限制供水。 第二步：第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外 表皮切成表皮切成4cm的小块。的小块。 第三步：第三步：制作混合酶液（纤维素酶制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶和果胶酶0.5 % ）并加入的）并加入的0.7 mol甘露醇甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6。 第四步：第四步：将小块烟叶放入混合酶液将小块烟叶放入混合酶液25 处理处理810小时小时 第五步：第五步：过滤、离心、洗涤（过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此）。如此23次、得原生质体。次、得原生质体。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5原生质体分离过程原生质体分离过程（以叶片为例）（以叶片为例）过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5 原生质体原生质体叶片叶片 原生质体原生质体愈伤组织愈伤组织陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5（二）（二） 原生质体纯化原生质体纯化 酶处后得到混合液包括：酶处后得到混合液包括： 原生质体、细胞团和组织碎片原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。酶液除去，才可以继续培养。 原生质体纯化方法：原生质体纯化方法： 离心沉淀法离心沉淀法 漂浮法漂浮法 接口法接口法 陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51 1、离心沉淀法、离心沉淀法 原理：原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后应用原生质体的比重大于溶液，离心后原原 生质体生质体沉于底部。沉于底部。 步骤：步骤： 第一步：第一步：原生质体溶液用原生质体溶液用400目网筛过滤。目网筛过滤。 第二步：第二步：离心（离心（5001000r/min离心离心56min）。）。 第三步：第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新 悬浮，再离心沉淀。如此悬浮，再离心沉淀。如此23次。次。 第四步：第四步：用原生质体培养液洗用原生质体培养液洗1次，收集原生质次，收集原生质 体。体。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5洗涤液成分洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，甘露醇， 10mmol/LCaCl2 H2O, 0.7mmolK H2PO4,洗涤液洗涤液pH： 5.6陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52、漂浮法、漂浮法原理：原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。生质体漂浮在液体的表面。洗涤液：洗涤液：3%蔗糖蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇甘露醇+ 1480mg/LCaCl2 2 H2O 。或。或11%23%的的蔗糖溶液。蔗糖溶液。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5 3 、 接口法接口法（以柑桔为例）（以柑桔为例）25%25%蔗糖溶液蔗糖溶液13%13%甘露醇溶液甘露醇溶液原理原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，密度，原生质体介于两种溶液之间。原生质体介于两种溶液之间。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5（三）原生质体活力测定（三）原生质体活力测定1 1、FDAFDA法法2 2、TTCTTC法法3 3、酚藏花红染色法、酚藏花红染色法4 4、形态学观察法、形态学观察法 （以上见书（以上见书 128129128129页）页）陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5（四）影响原生质体数量和活力的因素（四）影响原生质体数量和活力的因素 1 1、供试材料、供试材料 2 2、酶的种类、组合和酶解时间、酶的种类、组合和酶解时间 3 3、渗透压稳定剂、渗透压稳定剂 4 4、质膜稳定剂、质膜稳定剂 5 5、pHpH值值陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5三、原生质体培养三、原生质体培养一）培养方法一）培养方法 平板培养、液体浅层培养、固液培养平板培养、液体浅层培养、固液培养二）影响原生质体培养的因素二）影响原生质体培养的因素三）原生质体再生三）原生质体再生陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51 1、平板（固体包埋）培养、平板（固体包埋）培养 原生质体纯化后，原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至离心，用培养基稀释至一定密度，再与一定密度，再与0.6%0.6%琼琼脂或低溶点琼脂糖脂或低溶点琼脂糖（3737 C C左右）混合，培左右）混合，培养于培养皿中。养于培养皿中。（一）（一） 培养方法培养方法陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51.1 饲养层培养饲养层培养方法一：方法一：X-X-射线杀死原射线杀死原生质体，与生活力正常的生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入原生质体混合，加入0.6%0.6%琼脂，制成混合液，培养琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。于培养皿中。方法二：方法二：X-X-射线杀死原生质体，射线杀死原生质体，与与0.6%0.6%琼脂混合，在培养皿中琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作饲养层，再将生铺成平板，作饲养层，再将生活力正常的原生质体与活力正常的原生质体与0.6 % 0.6 % 琼脂混合，培养于饲养层上。琼脂混合，培养于饲养层上。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51.2 共培养法共培养法 将生长迅速的原生质体培养物与难于将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合培养的原生质体混合 前者为后者提供生长因素或成分未知前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质但能促进生长的扩散型化学物质陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52、液体浅层培养、液体浅层培养用培养用培养基离心基离心用培养用培养基悬浮基悬浮陈传红陈传红 制作制作 2007 / 53、 固液共培养固液共培养 培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。生质体浅层培养。 固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。固体培养基固体培养基陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5（二）影响原生质体培养的因素（二）影响原生质体培养的因素 1、原生质体的活力、原生质体的活力 2、起始密度、起始密度 3、渗透压稳定剂、渗透压稳定剂 4、培养基成分、培养基成分 5、培养条件、培养条件 6、植物材料和基因型、植物材料和基因型陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5第一次分裂第一次分裂（三）原生质体再生（三）原生质体再生（Regeneration）再生细胞壁再生细胞壁荧光增白剂荧光增白剂（卡氏白（卡氏白)圆变为圆变为椭圆形椭圆形第二次分裂第二次分裂第第N次分裂次分裂小细胞团小细胞团肉眼可见的细胞团肉眼可见的细胞团愈伤组织愈伤组织陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5肉眼可见细胞团肉眼可见细胞团陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5愈伤组织愈伤组织陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5愈伤组织愈伤组织器官发生途径器官发生途径胚胎发生途径胚胎发生途径植株植株陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5第三节第三节 原生质体融合原生质体融合 是以原生质体培养技术为基础，借用动物细是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善起来的一门新型生物技术，胞融合方法发展和完善起来的一门新型生物技术，又称体细胞杂交。又称体细胞杂交。 不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和重组和/ /或核基因重组。或核基因重组。技术体系的技术体系的3 3个环节：个环节： 原生质体融合；选择融合体；原生质体融合；选择融合体； 杂种植株的再生和鉴定。杂种植株的再生和鉴定。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51 1、原生质体融合意义、原生质体融合意义 克服杂交不亲合克服杂交不亲合 克服生殖器官败育克服生殖器官败育 克服柑桔多胚克服柑桔多胚陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52 2、成、成 就就q1972年年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。建立第一株烟草体细胞杂种。q 1975年柑桔原生质体培养成功年柑桔原生质体培养成功；q现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木木本植物中本植物中柑桔柑桔最为成功。最为成功。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5番茄番茄+马铃薯？马铃薯？陈传红陈传红 制作制作 2007 / 53 3、融合方法、融合方法自发融合自发融合 (Spontaneous fusion)诱发融合诱发融合(induced fusion)物理和化学方法物理和化学方法NaNO3高高pH-高高Ca离子离子PEG电场融合电场融合陈传红陈传红 制作制作 2007 / 53.1 NaNO3法法19091909年：年：KusterKuster证实引起证实引起亚原生质体亚原生质体融合融合19701970年：年：PowerPower报道可重复控制原生质体融合报道可重复控制原生质体融合19721972年：年： CarlsonCarlson诱导原生质体融合获得首例杂种诱导原生质体融合获得首例杂种植株植株粉蓝烟草和朗氏烟草粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。体细胞杂种。NaNO3NaNO3的作用：的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：不足：诱导频率不高。诱导频率不高。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 53.2 高高pH - 高高Ca 离子法离子法1973年：年：Keller和和Melchers用用pH10.5的的50 mMCaCl2溶液在溶液在37时，时，诱发烟草叶肉原生质体融合。诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：优点：杂种产量高。杂种产量高。不足：不足：高高pHpH值对细胞有毒害作用。值对细胞有毒害作用。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 53.3 PEG法法 PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）（聚乙二醇） 1974年：年：Kao KN和和Michayluk采用此法大大采用此法大大提高融合频率。提高融合频率。 1976年：年：Kao发现用高发现用高pH和高和高Ca结合融合频结合融合频率更高。率更高。 用高钙强碱溶液代替培养基清洗用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5PEG法法特点：特点：融合频率高融合频率高可重复性强可重复性强植物植物 + + 植物植物植物植物 + + 动物动物动物动物 + + 酵母酵母诱发融合无特异性诱发融合无特异性毒性较低毒性较低陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5PEG法法 原理：原理： PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚；生质体凝聚； 在洗脱过程中，在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。面电荷重排。 粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。生质体的正性电荷部位相连而导致融合。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5-+-+-桥梁桥梁+-PEG被洗掉被洗掉+-电荷重排电荷重排+-原生质体膜接触原生质体膜接触+-融合融合示意图示意图陈传红陈传红 制作制作 2007 / 53.4 电融合法电融合法 Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合年首先利用此方法实现原生质体融合电融合仪电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场不均匀交变电场的作用下，使原生的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲一个点脉冲，使原，使原生质膜发生生质膜发生可逆性电击穿可逆性电击穿，从而导致融合。，从而导致融合。电融合仪电融合仪陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5电融合法原理：电融合法原理： 交流电场交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成着电极排列，形成串珠。串珠。+-+-+-+-+-+-负极负极正极正极+-+-+-+-+-陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5施加施加直流电场直流电场后，形成串珠的原生质体在后，形成串珠的原生质体在质膜接触质膜接触处发生穿孔处发生穿孔，开始遗传物质的交流。，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5原生质体的融合过程包括原生质体的融合过程包括3 3个主要阶段：个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)3)融合完成，形成球形的异核体或同核体融合完成，形成球形的异核体或同核体。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5原生质体融合后的培养同原生质体培养原生质体融合后的培养同原生质体培养供体供体- -受体式细胞融合受体式细胞融合包括包括非对称杂交非对称杂交和和细胞质杂交细胞质杂交两种方式。两种方式。非对称杂交非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质少量核物质(1(12 2条染色体条染色体) )和和全部细胞质全部细胞质融合；融合；细胞质杂交细胞质杂交是一亲本的是一亲本的细胞核和细胞质细胞核和细胞质及另一亲本的及另一亲本的全部细胞质融合全部细胞质融合，可能使两种来源不同的，可能使两种来源不同的核外遗传成核外遗传成分分( (细胞器细胞器) )与一个与一个特定的核基因特定的核基因组结合在一起，这种组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。杂种叫细胞质杂种。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 54 4、体细胞杂种细胞筛选、体细胞杂种细胞筛选1 1）互补选择法）互补选择法（两次不同培养条件的培养）（两次不同培养条件的培养）第一次培养条件第一次培养条件只适合于甲亲本只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：时间后，生存下来的是：1)1)未经融合的甲亲本；未经融合的甲亲本；2)2)甲甲甲甲融合的产物；融合的产物；3)3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。 转入第二个培养条件，转入第二个培养条件，只适合乙亲本只适合乙亲本原生质体生长，原生质体生长，甲原生质体死亡。甲原生质体死亡。两次培养之后，能存活下来的只有具两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞到互补的杂种细胞。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（FITC）异硫氰酸罗丹明异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出分别发出绿色绿色和和红色红色2 2）荧光染料法）荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。色。细胞分类器辨别和收集发两种荧细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。光的异核体。 但仪器价格昂贵，不常用。但仪器价格昂贵，不常用。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 55、体细胞杂种的鉴定、体细胞杂种的鉴定q 形态学形态学q 细胞学细胞学q 遗传标记遗传标记陈传红陈传红 制作制作 2007 / 55-1 5-1 形态学形态学 比较比较再生植株再生植株与与融合亲本融合亲本在形态上的在形态上的异同：株高、株型、叶片大小、形状、气异同：株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色。孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 55-25-2、细胞学、细胞学染色体形态和数目的比较染色体形态和数目的比较陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 55-35-3、遗传标记、遗传标记 SSR RFLP 同工酶同工酶 RAPD AFLP陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质再生植株同时具有亲本的带；再生植株同时具有亲本的带；再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在在另一种情况下具有另一个亲本的带。另一种情况下具有另一个亲本的带。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5RAPD带型带型陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5RAPD带型带型陈传红陈传红 制作制作 2007 / 56、体细胞杂种的应用、体细胞杂种的应用培养抗病的新品种培养抗病的新品种野生种的抗逆性转移到栽培种（马铃薯，烟野生种的抗逆性转移到栽培种（马铃薯，烟草）果树上，砧木，接穗草）果树上，砧木，接穗合成新材料合成新材料远缘杂交，科间远缘杂交，科间/属间，个体的育性问题。属间，个体的育性问题。转移细胞质基因控制的性状。转移细胞质基因控制的性状。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5 作砧木应用 果树砧木是处于嫁接口以下的地下部分，砧木本身的果实性状对于果树砧木是处于嫁接口以下的地下部分，砧木本身的果实性状对于地上部分的果实无什么影响，砧木要求抗性好，与地上部分亲和。地上部分的果实无什么影响，砧木要求抗性好，与地上部分亲和。陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51）生产无籽柚）生产无籽柚q 柚为我国特色水果，栽培面积已达柚为我国特色水果，栽培面积已达100万亩，其中万亩，其中50%为沙田柚为沙田柚q 沙田柚品质佳，但不足在于种子多，最沙田柚品质佳，但不足在于种子多，最 多可达多可达120粒粒q 能能否生产无籽或少籽柚？能能否生产无籽或少籽柚？应用实例：应用实例：陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5沙田柚，沙田柚，我国的柚子良种，种子多我国的柚子良种，种子多陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5沙田柚授以柑橘异沙田柚授以柑橘异源四倍体体细胞杂源四倍体体细胞杂种花粉后结果状。种花粉后结果状。（2000, 江西赣州）江西赣州）陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5横切面横切面陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5纵切面纵切面陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5对照果实对照果实处理果实处理果实对照种子对照种子处理种子处理种子陈传红陈传红 制作制作 2007 / 52）筛选商用品种）筛选商用品种 NOVA + SUCCARI SOMATIC HYBRID FRUIT陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5陈传红陈传红 制作制作 2007 / 5Succari + Minneola somatic hybrid fruits陈传红陈传红 制作制作 2007 / 51 1、简述原生质体定义。、简述原生质体定义。2 2、简述简述原生质体培养意义。原生质体培养意义。3 3、简述简述原生质体分离、纯化方法。原生质体分离、纯化方法。4 4、简述简述原生质体融合方法及原理。原生质体融合方法及原理。5 5、简述简述原生质体融合的意义。原生质体融合的意义。6 6、简述简述体细胞杂种鉴定方法。体细胞杂种鉴定方法。作业：作业：