乙肝疫苗制备ppt课件.ppt
乙肝疫苗的制备“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。乙肝疫苗的概念v乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。的最有效方法。 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。乙肝疫苗的发展史v乙肝疫苗形成于1986年，为了得到乙肝疫苗，研究人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的蛋白质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。 v1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些儿童，因为儿童的感染率极高。 v2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注射过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。乙肝疫苗的制备v目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗-重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。这种表面抗原不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体的能力。乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带着的血液，经纯化灭活等严格工序制备而来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、来源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血v基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技术生产的，即构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酵母、CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。利用重组酵母生产的叫重组酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量为每支5微克。它们都可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感，都可以放心选用。 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。v基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它系采用现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌或CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，通过培养这种重组酵母菌或CHO细胞来表达乙肝表面抗原亚单位。发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。乙肝疫苗的制造工艺v1.目的基因的获取v2.工程菌的构建v3.目的基因的表达v4. 蛋白质的分离纯化“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。目的基因的获取v编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取v一般目的基因的获取方法有: cDNA文库法, 化学合成法 ,反转录法“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。工程菌的选择vCHO细胞的特点v具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子v具有产物胞外分泌功能 ,便于下游产物分离纯化;v具有重组基因的高效 扩增和表达能力; v具有贴壁生长特性 ,且有较高的 耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进行悬浮培养 ,表达 水平较高;v CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白 ,利于外源蛋白的后分离“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。主要试剂限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒乙型肝炎表面抗原检测试剂盒DMEM 和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TMHBsAg 血凝检测试剂盒“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。主要试剂限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒乙型肝炎表面抗原检测试剂盒DMEM 和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TMHBsAg 血凝检测试剂盒“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。编码乙型肝炎表面抗原的基因PCR扩增提质粒与表达载体连接目的基因与克隆载体连接，转化转入CHO细胞中表达“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。蛋白质的分离纯化 “雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。固液分离离心沉淀 膜过滤 双水相萃取浓缩与初步纯化离子交换层析 疏水层析 亲和层析高度纯化DNA的去除 热原质的去除 病毒的去除“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。分离纯化的基本要求技术条件温和，保持其生物活性选择性好，达到有效分离纯化的目的技术间可以直接连接，节省工艺步骤收率高，过程快选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择根据分离单元之间的衔接来选择根据分离纯化工艺的要求来选择“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。分离纯化的流程v疏水柱层析v阴离子交换层析v凝胶过滤层析“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。1、发酵液的预处理连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩2、疏水柱层析介质： Butyl S Sepharose FF 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。3、阴离子交换柱层析介质：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。4、凝胶过滤柱层析介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析5、除菌收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品“雪亮工程是以区（县）、乡（镇）、村（社区）三级综治中心为指挥平台、以综治信息化为支撑、以网格化管理为基础、以公共安全视频监控联网应用为重点的“群众性治安防控工程”。
