WI-03-33绿脓杆菌的试验方法.doc

恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-33版 号A.0绿脓杆菌的测定方法页 次1/2生效日期2020/01/021目的制订绿脓杆菌的测定方法，对从事检测的操作人员进行培训指导，按测定方法操作。2适用范围:本方法适用于绿脓杆菌的测定。3. 职责 质检部对本测定方法实施负责。4. 程序4.1 仪器电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、净化工作台、手提式压力蒸汽消毒器、电热恒温水浴锅、生化培养箱 、显微镜4.2 器具烧杯（250ml）、量筒（100ml）、三角烧瓶（250ml）、试管、硅胶塞、白金耳、酒精灯、培养皿（90mm）、刻度吸管（1ml,5ml，20ml） 4.3 培养基、菌种： SCDLP培养液、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、染色液（革兰氏染色用）、绿脓菌素测定用培养基、酸盐胨水培养基、明胶培养基、琼脂培养基、乙酰胺培养基、普通琼脂斜面培养基。4.4 器具灭菌：与样液接触的所有器具（刻度吸管、培养皿等）应按下述方法灭菌：包好后置手提式压力蒸汽消毒器内12120分钟高压灭菌，或置于电热恒温鼓风干燥箱内1602小时干热灭菌。4.5 操作步骤取样液5 mL，加入到50 mL SCDLP培养液中，充分混匀，置352培养1824 h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，置352培养1824 h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。取可疑菌落涂片作革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验：氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1二甲基对苯二胺试液，30 s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。绿脓菌素试验：取23个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定培用养基斜面，352培养24 h，加入三氯甲烷35 mL，充分振荡使培养物中可能存在的绿恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-33版 号A.0绿脓杆菌的测定方法页 次2/2生效日期2020/01/02脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1 mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。硝酸盐还原产气试验：挑取被检菌纯培养物接种硝在酸盐胨水培养基中，置352培养24 h，培养基小倒管中有气者即为阳性。明胶液化试验：取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置352培养24h，取出放于410，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。42生长试验：挑取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42培养2448 h，有绿脓杆菌生长为阳性。4.6结果报告 被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。5记录保存：5.1质检保管5年。6相关操作规程6.1电热鼓风干燥箱操作规程6.2HWS-12型电热恒温水浴锅操作规程 6.3生化培养箱操作规程6.4YX手提式压力蒸汽消毒器操作规程6.5净化工作台操作规程 7相关记录7.1. 生物性能检测记录。编制：日期：审核：日期：批准：日期：