BDFACSCalibur流式细胞仪简单操作技巧步骤.doc

-*BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤一、开机1） 先打开净化交流稳压电源，其次打开110V稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。在图上用明显颜色标记出减压阀位置2） 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN位置。二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件1） 在苹果菜单下点击在屏幕下方点击CELLQuest（第四个图标） 启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击实验文件的左右上角的放大钮（红绿色），将实验文件窗口放大。2） 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。3） 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中， 横坐标X轴横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024，X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数， Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，；如果是双标，Y轴选择：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)，如果是单标，Y轴选择：SSC-H。点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中， 横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024，X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数， Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。5） 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。加直方图的描述6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。单色荧光只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择FL-1，纵坐标默认为Counts；若是双色荧光，需画2个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024，另一个横坐标选择FL-2-1024；7）在上面直方图中画出M1和M2，其中M1代表隐性数目（一般标示是101），M2代表阳性数目（除M1以外所有的部分）。8）从Stats菜单中选择Quadrant Stats（象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。三、建立仪器和计算机之间通讯 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer (快捷键Win+b)，此时会出现Acquisition Control 对话方框。四、仪器设置文件注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - Compensation。1） 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC（根据实验样品确定，一般细胞选择LIN，细菌选择LOG），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。2）从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。3）从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。五、 上样品、设置仪器使仪器处于High RUN，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据，用于仪器设置)，点击Acquire。 1、调节FSC/SSC探测器（电压）观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain 从1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的Pause。2、Gating 圈选细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射（FSC）与侧方散射（SSC）的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。1） 在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates Region list ，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。2） 选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。 3、调节FL1、FL2的探测器（电压）1）点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节FL1、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处。2）在Threshold 窗口，适当地提高FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。 3）点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光，不要再改动Detector/Amps、Threshold等数值。4、调节荧光补偿说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。1） High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。2） 移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中的Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。4）移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。六、收集实验数据1）决定储存细胞总数：预设之储存细胞总数为10000。如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage，并在出现的窗口功，确认Collection Criteria从10000 of All，再点击OK。 2） 找个档案匣准备储存数据，本机所有数据都贮存在D盘data盘中，按实验日期编排。从Acquire 菜单中选择Parameter Description，出现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随后出现之对话方框，选择Your Folder或新建活页夹，点击此对话方框的Select Your Folder（一般用实验日期来命名Folder）。3） 命名即将储存之文件名：点击Parameter Description对话方框的File，出现文件名编辑窗口，输入文件名（根据实验来决定），点击此对话方框的OK。4） Optional：如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。5）计数器Counters：从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度6）开始收集实验数据。LOW RUN（根据Counters来调节速度，一般保持在700-800/Second），将第一管样品放到检测区，在Acquisition Control窗口中，将 Setup 改成 Setup，此时CellQuest会自动显示 Your Folder文件名为资料文件名。点击“Acquire” 便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件文件名.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成文件名.002。等待下一指示。7）换上超纯水，清洗管路，直到Counters持续显示0/Second 30s (约为10-20s)，换上下一管样品，点击“Acquire” 启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕。七、退出软件并关机1）. 检品分析完毕后，记得从屏幕上方 File 指令栏选择 Save As，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。2） 检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取Disconnect to Cytometer 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件“File”“Quit”(遇有选项永远选择“Dont save”)，进行关机程序。 3）以2 ml 10 漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。重复上述程序，样品架上留约 1 ml DI water 。按STANDBY五分钟。4）先关闭计算机，其次关闭流式细胞仪，再次关闭110V稳压输出电源，先打开净化交流稳压电源。5） 向前拉开储液箱抽屉，先将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向），再取出废液桶，将废液倒进预先装有84的烧杯中，灭菌处理，装好废液桶，将减压阀方向调在RUN位置。