微流控芯片技术及其应用.doc

,.微流控芯片技术及其在生命科学中的应用摘要：微流控芯片最初起源于分析化学领域，是一种采用精细加工技术，在数平方厘米的基片，制作出微通道网络结构及其它功能单元，以实现集微量样品制备、进样、反应、分离及检测于一体的快速、高效、低耗的微型分析实验装置。随着微电子及微机械制作技术的不断进步，近年来微流控芯片技术发展迅猛，并开始在化学、生命科学及医学器件等领域发挥重要作用。本文首先简单介绍了微流控芯片的相关技术，然后主要阐述了其在蛋白质研究、细胞研究、DNA分析和测序、仿生研究等方面的应用。关键字：微流控芯片，生命科学，应用Abstract: Microfluidic chip technology originated from analytical chemistry, adopts microfabrication technologies to make microchannels on a chip about several square centimeters. The technology can integrate the samples injection, separation and detection into a single chip. The advantage of microfluidics is rapid, high efficiency and low consumption. With the progress of microelectronics and other microfabrication techniques, the technology of microfluidic chip developed rapidly recent years, and began to play more and more important roles in chemistry, biology and medical instruments. This artical introduced the related technologies of microfluidic chip, and then mainly expounded its applications in protein research, cell research, DNA analysis and detection, and bionic research.Keywords: microfluidic chip; life science; application前言微流控芯片是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的科学技术，具有将生物、化学等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上的能力，因此又被成为芯片实验室。在现阶段，主流形式的微流控芯片多由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现常规化学或生物等实验室的各种功能。微流控芯片的基本特征和最大优势是多种单元技术在卫校可控平台上灵活组合和规模集成1。根据研究领域的不同，微流控芯片实验室可简单划分为微流控芯片化学实验室、微流控芯片生物实验室、微流控芯片光学实验室以及微流控芯片信息实验室等，其中，最早形成的是微流控芯片化学实验室中的微流控芯片分析化学实验室。分析化学是微流控芯片最早最直接的应用领域之一，微流控芯片分析化学实验室的构建和完善是21世纪前20年分析化学发展的一个主流趋势2。1 微流控芯片相关技术 1.1 微流体控制及驱动技术微流控芯片中流体的操控尺度在微米量级，介于宏观尺度和纳米尺度之间，这种尺度下流体运动显示出二重性。一方面，微米尺度仍然远大于通常意义上分子的平均自由程，因此，对于其中的流体而言，连续介质定理成立，连续性方程可用，电渗和电泳淌度与尺寸无关。另一方面，相对于宏观尺度，微米尺度上的惯性力影响减小，黏性力影响增大，雷诺数变小(通常在10-6-101之间)，层流特点明显，传质过程从以对流为主转为以扩散为主，并且面体比增加，黏性力、表面张力及换热等表面作用增强，边缘效应增大，三维效应不可忽略。与此同时，微米尺度和纳米尺度又有很多重要的区别。在纳米尺度下，物体的尺寸和分子平均自由程相近，因此电泳淌度变得和横截面尺寸有关，偶电层电荷重叠，电渗减少，进而影响到给予流体的动量。此外，空间的压缩会改变大分子的形状，大分子的淌度也将受到非平面流速矢量场的影响，最终导致对流体的控制相对困难3。 1.2 分离技术分离是微流控芯片样品分析的重要一步。芯片中分离毛细管槽负载了大部分外加电压，其场强多在 200500V/cm 之间，因此在设计时应尽量设法降低负载电压4。为了提高分离的效率，微流控芯片中使用了许多方法，如Kutter根据HPLC中梯度洗脱的方法，设计了两个缓冲液池，内装不同极性的缓冲液，以不同的体积比混合缓冲液，再以此混合液作样品的支持电解质，实验表明效果较好，分离时间小于1 min5。 1.3 微液滴技术微液滴操控包括微液滴生成和微液滴驱动，按生成方式可以将操控微液滴的方法分为两大类。一类是被动法，即通过对微通道结构的特别设计使液流局部产生速度梯度来对微液滴进行操控，主要为多相流法6。该法的主要特点是可以快速批量生成微液滴；另一类是主动法，即通过电场力、热能量等外力使液流局部产生能量梯度来对微液滴进行操控，主要包括电润湿法7、介电电泳法8、气动法9和热毛细管法10。该法的主要特点是可以对单个微液滴的操控。与传统连续流系统相比11，离散化微液滴系统有一系列潜在优势，如消耗样品和试剂量更少，混合速度更快，不易造成交叉污染，易于操控等。 1.4 检测技术 分离物的高灵敏度检测对于微流控芯片有着重要意义。目前，微流控芯片的检测方法大体上可以分为3类：光学检测、电化学检测及质谱学检测。 紫外吸收检测法12是一种常规光学检测法，相应的检测器已经趋于成熟，但由于芯片的通道小、灵敏度不高，因此该方法已经不能够满足对低浓度和极微量样品分析的要求。激光诱导荧光检测是所有荧光检测中灵敏度最高的一种方法。多数情况下其检测下限可达10-1010-12 mol/L，所以该方法得到了广泛的应用。电化学检测13有安培法、电导法和电位法3种基本模式，其中安培法是应用最普遍的一种方法。其基本原理是：测量化合物在电极表面受到氧化或还原反应时，会失去或得到电子，产生与分析物浓度成正比的电极电流，通过测量微通道中的电流即可得到溶液浓度的变化情况。电化学检测的灵敏度可以与荧光检测相媲美，同时，因为微电极可以加工到芯片上，因此更适合于微芯片的检测。 质谱检测14的原理是根据分子质荷比的不同而达到检测的目的。其最大优点是能够提供分子空间结构信息，因此在生物大分子（如蛋白质）的结构研究方面具有独到之处。但因为质谱检测系统本身比芯片还要大，所以也很难实现整个系统的微型化。单一的检测方法将很难完成全部检测任务，因此应对多种检测方法的联合使用及新的检测方法进行研究。2 微流控芯片的应用 2.1 微流控芯片在蛋白质研究中的应用在蛋白质分析技术中，蛋白质芯片是一种高通量、微型化和自动化的新型分析手段。目前蛋白质芯片主要分两种：一种类似于 芯片，即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵，可特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析；另一种就是微流控电泳芯片，通过在玻璃片或硅片上设置各种微泵、微阀、微电泳以及微流路，可将生化实验室的分析功能浓缩固化在蛋白质芯片上，然后在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪中进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类。蛋白质芯片将为生物化学和分子生物学提供强有力的分析工具。相对于DNA芯片，蛋白质芯片的研究进展显得相对滞后，主要原因是15：（1）芯片材料表面的修饰方法尚不成熟；（2）样品制备和标记操作过于繁琐；（3）信号检测灵敏度低，如低拷贝蛋白质的检测和难溶蛋白的检测精度更加难以保证，因此需要研制和开发高度集成化样品制备及检测仪器。这些问题不仅为蛋白质芯片技术增加了难度，同时也是蛋白质芯片能否从实验室推向临床应用的关键所在。 Clemmens等人16制作出一种具有螺旋形通道网络的微流控芯片，可使微管沿着覆盖有驱动蛋白的螺旋轨道运动并对其进行实时监测和浓缩，称之为动力蛋白“绕行”。在细胞中，动力蛋白在物质运输及细胞组分构建等方面起着十分关键的作用。活性生物运输分子如驱动蛋白不仅被用在细胞体系中运输纳米尺度的物质颗粒，而且还可用于组装及定位细胞结构，它利用ATP水解所释放的能量沿着微管向其正极运输小泡。因此，掌握并控制这些动力蛋白的运动情况对于构建生物纳米材料是十分重要的。Clemmens等17在微通道上覆盖了一层驱动蛋白，并在蛋白溶液中加入ATP，因此用荧光标记的微管可在驱动蛋白的作用下，利用ATP水解所释放出的能量沿着轨道滑行。由于控制动力蛋白的运动十分关键，因此必须设计出最为适合的轨道。他们首先设计了种不同形状的通道网络即十字交叉形、三角交叉形以及螺旋形。结果表明，微管在前两种轨道中运动时会陷于拐角处而无法持续前行；而在螺旋形轨道中，微管能够一直沿着通道运动并最终浓缩聚集于螺旋中央。微流控装置的用途广泛，但目前流行的微流控装置最大的不足之处是它们需要大量辅助的外部设备，体积庞大且成本很高，这就极大地限制了它的应用。Garcia等18研制出一种全新的微流控装置，可以控制某种功能蛋白从脱水的无活性状态恢复至其功能状态。他们在微通道壁旁做了一个储藏室，在体系封合之前，往该室中装上浓缩的海藻糖及葡聚糖溶液，溶液中含有我们需要的化学试剂，如-半乳糖苷酶。当这种含有的-半乳糖苷酶的糖溶液凝固以后，形成一种储藏母体，然后将体系封合。这样，半乳糖苷酶就处于脱水的无活性状态。 RBG作为 -半乳糖苷酶的底物，本身不发荧光，但是当它被-半乳糖苷酶分解后，所得产物为半乳糖和荧光染料试卤灵。该分解反应是一个一步完成的简单酶促反应，其动力学曲线符合米氏方程，因此可以通过检测荧光强度来检测酶活力。当 8.2M的RBG溶液流过微通道并进入穴中时，可使葡聚糖母体溶解并释放出-半乳糖苷酶。该酶在溶液中从脱水的无活性状态转化为活性状态，并催化 分解，生成荧光产物试卤灵，通过检测荧光强度可以测得半乳糖苷酶的活力。结果表明，在整个实验过程中，储存室中的酶仍然保持着30%50% 的初始活力。酶活力之所以有如此大的浮动，可能源于所加酶溶液的体积不一致（15075nL ）。他们还比较了在其他条件相同的情况下，圆柱形与方形储存室对酶活力的影响，结果表明，用圆柱形储存室时酶活力较高，并且释放平稳，效果较佳。 2.2 微流控芯片在细胞研究中的应用微流控芯片技术用于细胞培养及其生化分析已引起较广泛的关注，如细胞操作，绿色荧光蛋白的表达，基因转染，细胞活性测试，细胞分离，细胞内钙离子的测量，激素分泌监测以及高通量的细胞含量分析等。自从Harrison等人19首次在微流控芯片上对细胞进行操纵及传输试验后，Yang等人20用微流控芯片研究细胞群体的排列行为，并用荧光检测其摄取钙离子的反应情况。微流控芯片技术在动物细胞的应用研究非常广泛，尤其是哺乳动物细胞。除上述的基本细胞培养以外研究者还开展了大量基于微流控芯片的正常细胞和肿瘤细胞操作、分析及其实践应用研究包括细胞分类、细胞融合、单细胞捕获与基因分析、细胞与微环境相互作用，细胞应答(如细胞形变、细胞骨架重组、细胞内蛋白分泌、及细胞趋化等)高通量药物筛选等21。各种以细胞培养为基础的微流控芯片应用不断涌现22极大地提高了细胞分析效率。例如，Sugiura等13制备了一种平行阵列式微腔细胞芯片，可同时开展7种抗肿瘤药物对人宫颈癌Hela细胞的抗癌作用研究。秦建华等24以临床抗肿瘤药物诱导肝癌(HepG2)细胞凋亡为模型，构建了一种细胞水平高内涵药物筛选微流控芯片平台，将细胞培养、药物浓度梯度生成、细胞受激和响应等过程完全集成在一块只有几平方厘米大小的芯片上完成。一次运行可同时产生64种药物作用条件并可获得192个细胞响应结果利用该芯片同时分析了药物作用后细胞线粒体膜电势、细胞核、细胞膜以及胞内氧化还原状态的变化结果显示，不同药物诱导细胞凋亡呈现不同的剂量效应该工作充分地体现了微流控芯片将多种单元技术灵活组合和规模集成的特点，与传统的多孔板技术相比，省去了配制和分配多种药物不同浓度溶液的繁冗操作，大大简化了细胞接种、受激、洗涤和标记操作过程，显著降低了细胞和试剂耗量。实现单细胞检测是微流控芯片在细胞研究中的发展方向。进行单细胞胞内组分分析一般有两种方式：一种是将细胞溶膜后结合电泳分离检测细胞组分；另一种是用刺激剂或不同浓度梯度的溶液对完整细胞进行刺激，使细胞释放出胞内组分，从而实现无损检测（多用于离子通道研究）。由于单细胞组分分析的目的与细胞计数不同，因此单细胞组分分析时，更多采取了比上述方法或更简便直接的方法来操纵细胞，如电压、液压控制，或两者的结合23。Wheeler等24通过多层软刻蚀技术用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造了多层微流控芯片，用来分析单细胞。低雷诺数的细胞悬液由T型通道顶部流向底部，向左右分成两股液流，在交点处出现静止点，在此刻蚀超微型隔离室，单个细胞落入隔离室后，而受隔离室体积的限制其他细胞不能进入，可从细胞悬液中迅速分离出单个细胞。隔离室左上侧为试剂R通道，左侧为缓冲溶液（SB）通道，通过一系列泵、阀控制，微体积的试剂被精确地引入隔离室，与细胞组分反应。他们在这个装置上进行了细胞内的Ca2+离子流实验，将衍生试剂、刺激剂相继灌注到微室中，细胞在受到刺激后释放出被荧光标记的 ，然后进行激光诱导荧光（LIF）检测。 2.3微流控芯片在DNA分析及测序中的应用 （1）DNA分析微流控芯片可用于迅速分离DNA限制性片段PCR产物，比常规的毛细管电泳分离要快得多。把PCR扩增反应缩微集成到硅芯片上，珠蛋白目的基因进15min的扩增，然后仅用2 min就可完成PCR产物的分离，整个分析过程不到20 min。沙门菌基因组DNA的PCR产物可在45 min内分离，不需人工转移其产物，而且可实时控制PCR的扩增。简并寡核苷酸引物PCR扩增人基因组DNA，产物小于25 bp时，可引入芯片用于进一步杂交点突变、多组分的PCR分析。Larry等25设计混合样品多PCR产物电泳芯片分离，可同时分析10个以上PCR反应产物，尤其适用于基因作图分析，以及遗传性疾病诊断。在微流控芯片上观察荧光标记DNA的重复三联体序列，分离速度是常规毛细管电泳的十几倍。林炳承课题组以大量的临床实际样品为对象，以病原体基因检测、基因分型和基因突变检测为基本途径，验证了微流控芯片进行基因诊断和遗传多态性分析的可行性。开展了严重急性呼吸系统综合征(SARS)病毒26、高血压易感基因27以及肿瘤相关基因(P16基因)甲基化28等临床样品的规模检测。利用自行研制的微流控芯片系统，结合逆转录多重PCR扩增反应，完成了对18例疑似SARS患者咽拭子样品的检测。将微流控芯片技术与PCR一限制性片段长度多态性(RFLP)方法联用，完成了对123例原发性高血压患者和103例对照人群血管紧张素原(AGT)基因核心启动子区(-6A/G)的基因多态性分析，并对两组人群ACT基因的基因型及等位基因频率分布进行比较，完成了对93例不同肿瘤患者和66例对照人群P16基因的甲基化检测和大量临床疑诊样品多种病原体基因(结核杆菌、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)的快速检测同时，结合序列特异性引物分析(SSP)开展了对疑似强直性脊椎炎样品白细胞相关抗原(HLAB27)基因等的相关测定，以及不同组织岩藻糖基转移酶基因表达研究等工作。（2）DNA测序用微流控芯片四色标记法测序，可在540s分离个150碱基，准确率在70%以上29。常规DNA测序需要制备微升级的样品，试剂消耗量大，将纳升级的样品制备系统缩微到芯片上进行测序，可在分离前除去多余的引物、盐份、核苷酸等，所用测序体积是Sanger双脱氧链终止法的1/300 ，测序成本明显降低，而且可进行固相测序。 2.4 微流控芯片在仿生研究中的应用沿着仿生模拟的研究方向和思路，使得微流控芯片技术对于细胞与微环境时空控制方面的能力在动物细胞生物相关性研究中得到了充分的展示。Ho等30设计制备了一种细胞捕获芯片，可以通过芯片底层同心电极阵列的电场诱导实现肝细胞在微腔内的辐射式串珠状排列，然后将人脐静脉内皮细胞灌注人间隙，用以模拟肝脏组织。该研究证实了体外重建肝小叶的可能性。Liu等31采用集成微流控芯片技术构建了一种用于细胞与微环境相互作用动态研究的芯片系统。该芯片采用多层软光刻技术制备，通过气动微阀控制液流、细胞以及细胞微环境，可开展多种微环境模式的细胞刺激应答研究。该研究实现了在芯片内表面处理、细胞定位装载以及异型细胞共培养等连续化实验操作。并开展了针对肿瘤细胞(HepG2肝癌细胞)与基质细胞(3T3成纤维细胞)相互作用的动态系列化操作与分析研究。 李伟萱等人32针对体外环境对受精和胚胎发育的影响，现有人工辅助生殖技术存在受精成功率低和胎儿出生后风险高的问题，发展了一种微流控芯片子宫，芯片包含3层结构，顶层和底层为PDMS而中间层为多孔PC膜，芯片顶层含有宽500m，高110m蜿蜒形通道，通道中交错分布一系列用于捕获卵细胞的弧形筛网，筛网直径150m，由6根直径35m的微柱围成。芯片底层含有4个平行的矩形通道(6mm3 mm110m)，两端与共同的入口和出口连接。通道底面具有43微柱阵列用于支撑PC膜。通过使用子宫内膜细胞-胚胎共培养以及连续灌流方式细致模拟子宫环境以促进胚胎生成。利用上述芯片子宫，完成了排卵、受精、着床以及胚胎发生等一系列实验过程。芯片子宫不仅操作简便，还可以获得较之传统方法更高的胚胎形成率。3 展望自20世纪90年代以来，微流控芯片技术的出现极大地促进了微型化操作与分析研究方法的发展。微流控芯片是通过在芯片上加工出微型通道和其他的功能单元，实现样品的进样、反应、分离和检测等过程。它是一种多功能快速、高效、试样用量少的微型实验装置，其最终目标是建立微全分析系统（-TAS）或缩微芯片实验室（lab on a chip）。微流控芯片在生命科学研究领域的广泛渗透，在很大程度上提高了人们对生物个体及其自身的微观认识。基于微流控芯片的细胞分析，促进了该技术在生命科学及其相关研究领域的应用，尤其在活细胞结构与功能相关生命活动分析，及人类生活实践密切相关的应用分析研究。采用大规模阵列化集成细胞芯片技术实现的快速、高通量药物毒性分析与筛选，有望解决一直困扰制药业领域新药研发周期长的难题；同时，各种环境污染物监测芯片和临床诊断芯片的问世，为进一步改善和提高人类自身健康及其生活环境提供了可能。子宫芯片的出现，可以让我们尝试研究出肝脏芯片、心脏芯片等等人体器官芯片，可用于模拟体内的药物筛选，节省人力物力和时间，更甚者，将器官芯片发展得成熟和理想之后，可以进行体内移植。尽管目前的微流控芯片技术可以完成高度时间与空间控制性细胞操作分析，但其实现的细胞生长环境距离实际的体内细胞微环境还相差甚远。假若微流控芯片系统能够构建出完整的细胞培养环境，它将很可能取代传统细胞培养和动物研究模式，真正成为新一代的细胞生命研究平台。参考文献1 林炳承微纳流控芯片实验室M北京：科学出版社，2013：1-62 林炳承，秦建华微流控芯片分析化学实验室J高等学校化学学报，2009，30(3)：443-4453 王立凯，冯喜增微流控芯片技术宅生命科学研究中的应用J化学进展，2005,17（3）：482-4984 Klank H, Kutter . 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