基因克隆简介ppt课件.ppt

采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物基因克隆简介基因克隆简介 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一一. DNA分子克隆的基本原理分子克隆的基本原理v基因克隆（基因克隆（gene cloning）或分子克隆或分子克隆,又称为重组又称为重组技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代大量的子代DNA分子的过程。分子的过程。v克隆（克隆（clone）一指含有单一的一指含有单一的DNA重组体的无性重组体的无性繁殖系，或指将繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程繁殖系的过程(cloning)。 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一个完整的基因克隆过程包括以下步骤一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 v.获得待克隆的获得待克隆的DNA片段（基因）；片段（基因）；.目的基因与载体在体外连接；目的基因与载体在体外连接；.重组重组DNA分子导入宿主细胞；分子导入宿主细胞；.筛选、鉴定阳性重组子；筛选、鉴定阳性重组子；.重组子的扩增与或表达。重组子的扩增与或表达。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的的DNA片段。片段。2. 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组组DNA分子。分子。3. 将重组将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。寄主细胞）并与之一起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。目的基因。5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。类所需要的物质。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物二二. 用于基因克隆的工具酶用于基因克隆的工具酶 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1.1、限制酶概念提出的背景、限制酶概念提出的背景 20世纪世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象限制现象”。 1962年，年，WArber提出一个假设来解释上述现象提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位分子的某些部位，使外来，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另一种是修饰酶，可对自生的一种是修饰酶，可对自生的DNA进行修饰。进行修饰。1. DNA限制性内切酶限制性内切酶采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 能识别并切断外来能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为为限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1.2、限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的命名原则命名原则 限制酶的命名是采用限制酶的命名是采用Smith和和Athens提议的方案，提议的方案，即名称的即名称的第个第个1字母取自它来源细菌属名的第字母取自它来源细菌属名的第1个字个字母，大写；第母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名二个字母取自它来源细菌的种名的头的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第有第4个字母；最后用大写罗马数字，个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物EcoR IEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2 2个字母相同则其中一个可用种名的个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。第一和第三个字母。如如Hind 代表从流感噬血杆菌代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分离到的第株中分离到的第3个限制酶。个限制酶。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1.3、限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的分类分类 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为活性等，一般将限制酶分为I， 三大类。三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。类：基因工程的工具酶。类：基因工程的工具酶。类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25 bp27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。，对分子克隆操作亦无实用意义。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物首先由首先由H.O. Smith和和K.W. Wilcox在在1970年从流年从流感嗜血菌中分离出来。感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNA上的特殊靶序列（多上的特殊靶序列（多数是回文序列）。数是回文序列）。与与DNA的来源无关。的来源无关。1.4 II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是分离的第一个酶是 Hind 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：从识别位点处从识别位点处 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（3）粘性末端（）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG5-33-55-33-5采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 连接便利连接便利（4）粘性末端的意义）粘性末端的意义i）不同的）不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个）同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环环形分子形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物2. DNA 连接酶连接酶从细菌从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能环化现象推测，必定存在一种能把两条把两条DNA双链连接到一起的酶。双链连接到一起的酶。3.1 DNA连接酶（连接酶（ligase)的发现的发现DNA复制一定有断口。复制一定有断口。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1. 两种两种DNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。3.2 DNA ligase的特点的特点（2）T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，不但能连接粘性末端，还能连接还能连接齐平末端齐平末端。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA。（2）DNA3端有游离的端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团端有一个磷酸基团（P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：大肠杆菌中： NAD+ +2. 连接条件连接条件采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 基因载体是一类能自我复制的基因载体是一类能自我复制的DNADNA分子，其中的一分子，其中的一段段DNADNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源源( (目的目的) DNA) DNA而将目的而将目的DNADNA带入宿主细胞。带入宿主细胞。 三三. 分子克隆的载体分子克隆的载体采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物v载体具以下特征：载体具以下特征：v1) 具有自主复制能力；具有自主复制能力；v2）有可选择的标记基因（如，抗药基因）有可选择的标记基因（如，抗药基因）v3）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；切点；v4）分子量小，便于携带较大的）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外源源DNA后，不影响其复制能力后，不影响其复制能力5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主，）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开宿主自由扩散。并且不能离开宿主自由扩散。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物polylinkerv常用的载体有：质粒，常用的载体有：质粒，噬菌体，粘粒，病噬菌体，粘粒，病毒，毒，BAC，YAC等。等。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1.1.质粒质粒(plasmid(plasmid )载体载体 Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNA分子。分子。 Plasmid chromosome 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1 1、质粒是细菌染色体外能、质粒是细菌染色体外能自主复制自主复制的的环形双链环形双链DNADNA分子。分子。2 2、编码、编码抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的质粒叫的质粒叫R R质粒。质粒。3 3、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为粒分为严紧型复制质粒严紧型复制质粒（拷贝数少，为（拷贝数少，为1-51-5个）与个）与松弛型复制质粒松弛型复制质粒（拷贝数多，可达（拷贝数多，可达10-20010-200个拷贝）。个拷贝）。4 4、质粒的、质粒的不亲和性不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。象。1） 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低2）天然质粒的局限性）天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长分子长 9.1 kb。但只有一个但只有一个EcoR I切点充切点充当克隆位点，当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。（2）筛选标志不理想）筛选标志不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。）。唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基正好位于这个基因的内部。因的内部。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 第一阶段（第一阶段（19771977年前）：天然质粒和重组质粒的年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322pBR322。 3）发展概况）发展概况pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于一部分来源于质粒的氨苄青霉素抗性基质粒的氨苄青霉素抗性基因（因（ampr）；）；第二部分来源于第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因质粒的四环素抗性基因（tetr）；）；第三部分则来源于第三部分则来源于ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复制起点（复制起点（ori）。）。pBR322质粒质粒采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物vpBR322pBR322质粒载体优点：质粒载体优点：v第一，具有较小的分子量。第一，具有较小的分子量。pBR322pBR322质粒质粒DNADNA分分子为子为4 363bp4 363bp。v第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。的选择记号。v第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积之后，每个细胞中可累积1000100030003000个拷贝。这就个拷贝。这就为重组为重组DNADNA的制备提供了极大的方便。的制备提供了极大的方便。 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物pBR322AmpTet采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物第二阶段：第二阶段：增大载体容量增大载体容量（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立多多克隆位点区克隆位点区和新的和新的筛选标记筛选标记基因。如基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 2.7kb采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Z Z编码编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。糖和半乳糖。lacZ的的a肽互补蓝白斑选择原理：肽互补蓝白斑选择原理： 乳糖操纵子乳糖操纵子采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物异丙基硫代半乳糖苷（异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl isopropyl thiogalactosidethiogalactoside：IPTGIPTG）结构上类似于别乳糖，）结构上类似于别乳糖，是乳糖操纵子非常有效的诱导物。可诱导是乳糖操纵子非常有效的诱导物。可诱导laclac操操纵子表达，但不能被纵子表达，但不能被-半乳糖苷酶水解。半乳糖苷酶水解。 异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷IPTG异丙基异丙基 硫代硫代-D-半乳糖半乳糖苷苷 Isopropyl-beta-D-thiogalactoside 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b b-D-galactoside）5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖糖苷半乳糖糖苷采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物b b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解分解成半乳糖和一个成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的物质的物质5-溴溴-4-氯靛氯靛蓝。蓝。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝b b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 lacZ的的a肽互补肽互补1）a a-肽（肽（ lacZ ）：）：b b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），该段基因序列连接到氨基酸），该段基因序列连接到pUC载体上。载体上。受体菌基因组的受体菌基因组的b b-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的缺失缺失a a肽（氨基端有缺失），不能形成肽（氨基端有缺失），不能形成活性酶，不能分解活性酶，不能分解Xgal 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物pUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ 编码编码a a肽与这个肽与这个缺失突变的缺失突变的b b-半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，又，又能分解能分解Xgal。产生蓝色物质。产生蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受体菌受体菌lacZ载体载体lacZ与与a互补互补采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 a互补的插入失活互补的插入失活pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位点端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源的合成，但插入外源基因就会阻止基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。的合成。不能互补。 lacZ53a a肽移码突变肽移码突变lacZ53a a肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNA采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：诱导的结果：采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物v第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如不同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。子载体，表达型载体及各种探针型载体。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZAmprori采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割成大切割成大小合适的片断，并将小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与适当都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和保存和扩增扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。1）基因文库的构建）基因文库的构建（1） 基因文库（基因文库（gene library）1.目的基因片段的获得目的基因片段的获得四四. DNA 的克隆过程的克隆过程采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2） 基因组文库的构建基因组文库的构建1、提取研究对象基因组、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小，制备合适大小的的 DNA 片段，片段，2、载体、载体DNA的制备；的制备；3、DNA 片段与载体连接与包装片段与载体连接与包装 ；4、重组噬菌体侵染受体菌；、重组噬菌体侵染受体菌；5、基因文库的鉴定和扩增、基因文库的鉴定和扩增 采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物v 原位杂交，是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌原位杂交，是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之释放出来，并使之固定在滤膜上并固定在滤膜上并在原位发生溶菌、在原位发生溶菌、DNA变性和杂交变性和杂交作用作用。v 原位杂交主要用来从用质粒或原位杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基构建的基因文库中寻找阳性克隆，当得到阳性克隆后，再通因文库中寻找阳性克隆，当得到阳性克隆后，再通过过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。上万个菌落，达到高通量筛选的目的。（3 ）基因文库的筛选）基因文库的筛选采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物原位杂交原位杂交采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（1） cDNA以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。（2） cDNA library2） cDNA文库的构建mRNAcDNA3355反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将这些，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称增，称cDNA文库。文库。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（4） 构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取（3） cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2）mRNA的分离纯化的分离纯化采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（3）cDNA的合成用用Oligo dT（或随机引物）作引物，逆（或随机引物）作引物，逆转录酶能以转录酶能以RNA为模板合成为模板合成cDNA。（4 4）cDNA与载体连接与载体连接在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即，即可与载体连接，转入受体菌。可与载体连接，转入受体菌。采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用采用PP管及配件：根据给水设计图配置好管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 适用于分离在特定组织中表达的基因适用于分离在特定组织中表达的基因、在细、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，同时也可有效地用来分离经特殊处调节的基因，同时也可有效地用来分离经特殊处理而被诱导表达地基因。理而被诱导表达地基因。 3） mRNA差别杂交或扣除杂交法