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    2022年细胞冻存、解冻方法与细胞计数 .pdf

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    2022年细胞冻存、解冻方法与细胞计数 .pdf

    一、细胞冷冻保存1.材料:生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650) 、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020) 、0.4( w/v )trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法:(1)传统方法 : 冷存管置于410 分钟 -2030 分钟 -80 16 18 小时 ( 或隔夜 )- 液氮槽 vaporphase长期储存。-20不可超过1 小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡, 亦可跳过此步骤直接放入-80 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1-3 /分钟之速度由室温降至(-80 以下)-120 ,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤:(1)冷冻前24-48 小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜( DMSO)至 20% 浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液( 约 0.1ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO 最后浓度为510) ,使细胞浓度为1 5106cells/ml ,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1 2ml/vial ,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后, 注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项:(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase) 且存活率高之状态,约为8090致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70 度可保存数月。(3) 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级, 无菌且无色(以 0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以 510ml 小体积分装, 4避光保存,勿作多次解冻。 Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10% 甘油冻存。(4)冷冻保存之细胞浓度:normal human fibroblast:13106cells/ml hybridoma:13106cells/ml ,细胞浓度不要太高,某些 hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻 24 小时后死去。adherent tumor lines:5 7106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而 HeLa 只需 13106cells/ml other suspensions:510106cells/ml ,human lymphocyte须至少 5106cells/ml 。(5)冷冻保护剂浓度为5 或 10 DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。(6)冻存可用10% 90% 的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20% 终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4 度时), 复苏存活率在80% 90% 以上,对原代培养细胞, 以 90%名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页,共 3 页 - - - - - - - - - 血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管 / 培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤:(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。(3)将新鲜培养基置于37水槽中回温,回温后喷以70% 酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。(4)取出冷冻管,立即放入37水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,以70% 酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内( 稀释比例为1:10 1:15) ,混合均匀,放入CO2 培养箱培养。取0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如 DMSO 或 glycerol) ,依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm ,5 分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理:(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2)血球计数盘一般有二个chambers ,每个 chamber中细刻 9 个 1mm2 大正方形,其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格,深度均为0.1mm 。当 chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2 0.1mm=1.0 x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104 ,即为每ml 中之细胞数目。(3)存活测试之步骤为dyeexclusion ,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整, 染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue ,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数) 100% 。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长, 部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。2、材料:0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061); Erythosin bluish stain ;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa+/Mg+freesaline; 血 球 计 数盘 及 盖 玻片 (Hemocytometerandcoverslip); 计 数器(counter) ; 低倍倒立显微镜; 粒子计数器 (Coultercounter,CoulterElectronics)。 白细胞稀释液 (4%乙酸溶液)。3、步骤:(1)取 50l 细胞悬浮液与50l trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。(2)取少许混合液(约 15l)自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100 倍倒立名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页,共 3 页 - - - - - - - - - 显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色( 或红色 -Erythrosin bluish)。(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与 trypanblue等体积混合 ),最后乘以104 ,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞 (或计下线与左线之细胞)。注 : 4大 格 细 胞 总 数 稀 释 倍 数 104/4=细 胞 数 /ml; 每 一 大 格 的 体 积=0.1cm 0.1cm 0.01cm=10-4ml 计数板计数时,最适浓度为510105 细胞 /ml ,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例:T75 monolayer culture制成 10ml 细胞悬浮液,取0.1ml 溶液与 0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。活细胞数 / 方格: 55, 62, 49,59;死细胞数/方格: 5,3,4,6;细胞总数=243 平均细胞数 /方格 =60.75 ;稀释倍数 =2 ;细胞数 /ml :60.751042(稀释倍数)=1.22 106 ;细胞数 /flask (10ml ) :1.22106 10ml=12.2 106 存活率: 225/243 92.6%名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页,共 3 页 - - - - - - - - -

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