基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究.docx

课题类型：  探索导向类申请受理编号：  SQ2006AA05Z109513国家高技术研究发展计划（863计划）专题课题申请书 技术领域名称：先进能源技术领域专题名称：氢能与燃料电池技术申请指南技术方向：制氢技术课题名称：基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究申 请 人：程军依靠单位：浙江大学中华人民共和国科学技术部2006-09-05序号姓名性别出生日期职称职务专业为本课题工作时间(人月)课题组中职务(组长、副组长或成员)在课题中分担的任务所在单位1程军男 1974年8月 高级职称 无 环境类 24 组长 项目负责人  浙江大学  2谢斌飞女 1981年10月 其他人员 无 环境类 30 成员 产氢代谢机理  浙江大学  3戚峰女 1980年7月 其他人员 无 环境类 30 成员 秸杆发酵产氢  浙江大学  4张传溪男 1960年1月 高级职称 副所长 生物科学类 18 副组长 基因改造理论  浙江大学  5刘建忠男 1965年2月 高级职称 无 环境类 12 成员 高效产氢工艺  浙江大学  6李春雨男 1973年5月 中级职称 无 生物科学类 12 成员 基因改造秸杆  浙江大学  7宋文路男 1983年7月 其他人员 无 生物科学类 30 成员 产氢菌植入抗性基因  浙江大学  8鲍艳原女 1968年6月 高级职称 无 生物科学类 30 成员 基因改造产氢菌  浙江大学  9苏会波男 1983年12月 其他人员 无 生物科学类 30 成员 产氢菌剔除不利基因  浙江大学  10潘华引男 1985年3月 其他人员 无 环境类 30 成员 秸杆高效水解  浙江大学  课题参加总人数 10 人。 其中：高级职称 4 人， 中级职称 1 人， 初级职称 0 人， 无职称 5 人； 其中具有：博士学位 5 人， 硕士学位 0 人， 学士学位 5 人， 其他 0 人； 合计：投入 246 人月2.1 课题组长、副组长资历情形（从事过的主要研究任务及所负责任和作用，主要研究成果、发明专利和获奖情形，在国内外主要刊物上发表论文情形，完成其他科技计划课题情形，特别是近五年取得的与本申请课题相关的研究成果情形，字数要求1000字以内）程军，男，1974年8月生，2002年3月浙江大学工程热物理专业博士毕业，现为浙江大学能源清洁利用国家重点实验室副教授，研究领域为微生物制氢以及能源高效清洁利用。在微生物制氢领域作为项目负责人承担了1项国家自然科学基金项目“城市固体有机废弃物以微生物发酵法联产氢气和甲烷的机理研究”、1项全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目、1项霍英东优选资助基金项目和1项浙江省科技攻关项目，作为主要参加者完成了10余项国家和省部级重点科技攻关和基金项目。2001年和2004年两次获得国家科技进步二等奖，2003年获得浙江省科技进步一等奖，2004年获得全国优秀博士学位论文奖。曾合编高校教材1部，在国内外重要学术期刊上发表论文50余篇。致力于对生物质及固体有机废弃物的高效水解及微生物法产氢研究，提出了发酵法联产氢气和甲烷的新工艺，探索了发酵和光合耦合法高效产氢体系，并对秸杆生长细胞和产氢菌株的基因工程改造进行了可行性研究，使系统的能源转化率获得突破性提高，取得了一定的研究成果，已发表和录用重要期刊论文5篇。 张传溪，男，1960年1月生，教授，博导。1985年毕业于浙江农业大学植物保护系获硕士学位，1991年赴日本京都工纤大应用生物学科从事生理生化研究，1993年任浙江农业大学副教授，1994.1-97.6在职攻读博士学位，在中国科学院上海生物化学研究所从事分子生物学和基因工程研究，博士学位论文“杆状病毒Ph、PK基因研究及人EPO基因在杆状病毒-昆虫系统中的表达”被评为全国优秀博士学位论文。1998年浙江大学应用昆虫研究所任教授、副所长。2001.5-2003.8年日本学术振兴会特别研究员。现为浙江大学分子生物学实验室教授、博导，主要从事分子生物学和基因工程研究。近年来除从事病毒基因功能研究外，还致力于原核和真核表达、产氢菌株的基因工程改造研究，在产气肠杆菌剔除乳酸基因片段和表达产氢酶基因方面取得了一定的研究成果。学术兼职：应邀任美国国家自然科学基金会（NSF）评审专家、中国病毒学编委。曾先后主持4项有关功能基因分析的国家自然科学基金项目和1项教育部专项基金；参加 “863”、“973”有关分子生物学和基因工程项目多项。已先后在国内外学术刊物发表有关研究论文100余篇（其中SCI收录32篇），主编著作2本，参编5本，授权专利4项。 2.2 课题组长、副组长目前承担863计划和其它国家科技计划课题情形（包括人员姓名、承担课题名称、课题经费数、课题起止时间、所属科技计划名称等信息）姓名承担课题名称课题经费数(万元)课题开始时间课题终止时间所属科技计划张传溪 基因工程表达AChE基因及其在绿色农药先导物挑选应用 50 2003-9-1 2008-8-30 973计划 程军 城市固体有机废弃物以微生物发酵法联产氢气和甲烷研究 24 2005-1-1 2007-12-30  其他说明事项：程军副教授负责的该国家基金项目与本次申请863项目的研究目的和内容完全不同，但是都属于微生物发酵产氢研究领域，所具备的科研支撑条件、主要仪器设备以及积存的发酵产氢理论知识和实践体会，可以为本次项目的顺利完成提供良好的平台。 张传溪教授负责的该973项目二级课题与本次申请863项目的研究目的和内容完全不同，但是都属于基因工程研究领域，所具备的科研支撑条件、主要仪器设备以及积存的基因工程理论知识和实践体会，可以为本次项目的顺利完成提供良好的平台。 2.3 课题组长及课题组主要成员是否曾就相同或类似课题863计划和国家其他科技计划提出申请（如有，请说明申请人姓名、申请科技计划名称、申请课题名称、申请时间、申请结果等情形，并说明与本课题申请的关系）无。 3.1、课题简介（简要说明课题的目的意义、主要研究内容、预期目标等，字数要求1000字以内）能源与环境是当今世界两大主题，化石能源的日趋匮乏以及燃烧对环境产生的庞大危害要求人类加速研发干净高效和可再生的新能源。由于氢气具有很高的能量密度，燃烧产物是水，并且没有污染性，故是一种理想的清洁能源。近年来，世界范畴内以氢为原料的燃料电池的迅猛发展加速了氢能经济的进程，而以氢的制备、储存和利用为内容的研究开发已成为世界各国竟相争夺的高科技制高点之一。另一方面，我国农村存在量大面广的废弃生物质，如秸秆等大部分直接焚烧的能源利用效率不到30%，造成严重的环境污染和资源浪费。因此，如何高效清洁地利用生物质能成为我国经济社会可连续发展的迫切需求。利用秸杆等生物质以微生物法制取氢气对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意义，是一个处于国际学术前沿的热点研究课题，具有重要的学术价值和应用前景。 如何使富含纤维素的秸杆等生物质高效降解成可资利用的还原糖是利用其发酵产氢的首要技术难点和重大关键点。而其能否获得产业化应用的瓶颈问题是过程的经济性，目前国际上最新的研究方向是通过基因工程改造产氢菌种和氢酶，并开发高效产氢反应器。因此，本项目提出基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究。第一构建转基因水稻，在水稻中转入能在秸杆特异组织中表达（对活体植物茎杆本身无害）的纤维素酶和半纤维素酶等基因，在获得高产量稻谷的同时又能获得在加工过程中被自身植株生长产生的酶高效水解为还原糖的秸秆。其次培养挑选高效产氢菌株，通过knock out 技术，剔除产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因，抑制产氢细菌在代谢过程中形成乳酸等的有效途径；同时通过克隆Fe-hydrogenase基因，在产氢细菌中转入Fe-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平。并且将高效产氢菌Enterobacter aerogenes的产氢酶重组入非产氢抗性菌的基因组，获得耐酸性和其它对环境耐受力强的产氢菌株。研究转基因新型产氢菌的发酵产氢机制及其代谢条件，加入抑制剂提高产氢代谢过程中NADH含量，通过控制代谢途径的导向直接为氢酶提供还原力，以增强其产氢效率。设计高效产氢反应器并优化其运行条件，研究pH值、氧化还原电势和温度等对转基因秸杆发酵产氢过程的影响规律和控制机理。预期目标是使转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢能力和能源转化率获得突破性提高。  3.2、课题主要研究技术的国内外发展现状与趋势，课题主要研究技术国内外专利申请和授权情形国际上许多国家投入巨资研究的微生物制氢是一项利用微生物的生理代谢作用分解有机物从而生产氢气的生物工程技术，它是一种符合可连续发展战略的可再生能源技术。它克服了常规制氢方法（如从煤、石油、天然气等化石燃料中提取或通过水电解法制取等）需要消耗大量化石燃料和能量、并且产生大量污染的弊病。目前在生物法制氢研究方面主要分为发酵法和光合法两大类，其中发酵法具有产氢细菌生长速率快、产氢能力高、反应无需光源、发酵底料来源广等优点，所以更容易实现连续产氢和工业化生产。因此，利用秸杆等生物质以微生物法制氢对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意义，是一个处于国际学术前沿的十分活跃的热点课题，具有重要的学术价值和应用前景。国内外许多学者关于发酵法产氢的研究范畴主要局限于反应机理相对简单的富含水溶性碳水化合物（特别是葡萄糖）的有机废水，对于主要由复杂大分子有机质即不溶性的大分子碳水化合物、脂类物和蛋白质组成的生物质及固体有机废弃物的发酵产氢问题较少研究。后者的厌氧消化产氢过程可分为水解、酸化和产氢产乙酸三个阶段，由于其降解产氢过程的复杂性，国内外在该领域的研究方兴未艾，目前已逐步引起许多学者的高度重视。国外已有部分相关报道，如日本在90年代末到本世纪初，在暗发酵制氢方面的科研投入大大增加，特别在2001-2004年产生了大量基础性的研究结果。日本东北大学曾将餐厅剩菜与粪便污泥混合配成培养基料，利用加热预处理的厌氧活性污泥和大豆粉仓中富含的产氢菌进行发酵制氢，发觉底料的产氢潜力分别高达140ml/g和180ml/g，而厌氧活性污泥的接种产氢速率可高达45ml/（gVSSh），2004年日本产业技术研究所的废弃食物产氢项目已经进入中试阶段。另外，韩国、新加坡、印度在此领域的研究也比较活跃。而国内对于固体有机废弃物发酵产氢的研究才刚刚起步，如中国科学院、清华大学、中国科技大学、厦门大学、哈尔滨工业大学、郑州大学等曾对固体废弃物发酵产氢进行了一些探干脆研究，取得了一定的研究成果。众多专家一致认为：如何使生物质及固体废弃物高效降解成可资利用的还原糖是利用其发酵产氢的首要技术难点和重大关键点。而生物质发酵产氢能否获得产业化应用的瓶颈问题是过程的经济性，即如何降低发酵制氢的成本，使之可以和化石能源催化重整制氢的经济性相比拟，或者可以与其他生物能源过程（即生物制甲烷、燃料酒精、生物柴油）相竞争。其核心问题是如何提高氢气从葡萄糖的转化率、如何降低底物成本、以及如何在生物反应器水平上实现高效产氢。目前国际上最新的研究方向是从现有产氢纯菌的工艺优化中走出来，开发新的产氢菌种，通过基因工程改造产氢菌及氢酶，并开发高效的产氢反应器。利用富含纤维素的秸杆等生物质大规模高效低成本地发酵转化为燃料乙醇、甲烷或氢气等清洁能源是目前国际上的一大热点课题。若能通过基因工程手段在目标植株细胞中成功表达降解不同生物体高分子的酶，如将纤维素酶基因片段植入水稻的基因组中，而在收成的水稻秸秆中获得大量纤维素酶，使得秸杆在后续的加热到90左右水解过程中不需要酸碱预处理和外加纤维素酶等，即能高效降解成产乙醇细菌或产氢细菌直接可资利用的小分子还原糖，则能大幅度降低秸杆水解糖化和发酵利用的处理成本，并大幅度提高其转化效率，取得庞大的经济和社会效益。目前美国麻省理工学院、密歇根州立大学、加州大学Davis分校、杜邦公司和Syngenta公司等正在加紧开展相关的研究探索，主要在玉米、甘蔗等植株生长过程中表达纤维素酶和半纤维素酶，以获得更有利于秸秆高效水解的农作物，但至今很少见到公布的文献报导1。厌氧发酵产氢中起主要作用的是氢酶，氢酶分为放氢酶和吸氢酶，分别催化反应的正逆反应。作为一种有机金属酶类，氢酶对氢代谢至关重要，研究其基因结构和空间结构、催化中心、电子载体种类和传递顺序等具有很高的理论价值，深入挖掘这些生物信息对于人们定向改进氢酶性能，获得高产氢菌种具有指导意义。目前已经有超过100种的氢酶基因序列可以在基因库上获得，但是仍旧有大量已知产氢菌株的氢酶基因尚未克隆，获得更多的氢酶基因也是生物制氢研究的重要方向。Mishra2等分离出高产氢菌阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae IIT BT08的氢酶基因进而进行了酶分子特性研究。大肠杆菌的氢酶基因都属于NiFe氢酶，梭菌属的氢酶都属于铁氢酶，目前其中3株所具有的铁氢酶得到测序，但是关于其附属基因、调控机制还不清楚。梭菌的铁氢酶已经成功的克隆，并异源表达到光合细菌内，强化了光合菌的产氢过程。虽然一部分氢酶基因得到解析，但是整体进展仍旧比较缓慢而且不系统，有很大的研究探索空间。无论是纯种还是混菌培养，提高关键菌株产氢效率都是最重要的工作。单纯的条件优化手段已不能满足这一要求，需要运用分子生物学的手段对菌种进行改造，以达到高效产氢的目的。由于产氢细菌内的氢酶种类繁多，通过敲掉基因片段的方法是一个可行策略。Lindblad3已将这一策略应用到光合细菌Anabaena PCC7120中，敲掉了其中的吸氢酶HupL基因片段，使产氢速度比野生型高出了两倍。此外，通过蛋白质工程手段对氢酶进行强化，包括增加其活性、耐氧性也都是可行策略。通过复合诱变选育，得到遗传稳固好的高效产氢突变株，并提高菌种对环境的耐受力，在高产氢菌种的选育中耐高温或耐酸菌是值得重视的一个育种方向。有报道对产气肠杆菌进行激光诱变，挑选得到一株能够耐受pH3.0的高产氢突变株，产氢量较出发菌提高了484。任南琪教授在其CSTR反应器中分离出一株产氢发酵细菌ZGX4，以其为出发菌株，对其进行紫外和亚硝酸复合诱变选育，经过连续传代得到一株遗传稳固很好的高效产氢突变株YR1，产氢能力提高35，平均产氢速率提高235。此外，也可将产氢能力高的菌株的氢化酶植入一些虽然不产氢但是对环境耐受力高（如酸碱度、温度、底物浓度）的菌株，如在非产氢菌Escherichia coli中植入丁酸梭菌的氢化酶，产氢量可达到3.12molH2/mol葡萄糖，高于原丁酸梭菌2.2molH2/mol葡萄糖的产氢量6。运用代谢工程手段等现代生物技术手段对产氢细菌进行改造的研究目前在生物制氢领域还没有展开，是很值得深入研究的方向。Jonathan Wood Ward7 用10种商业用酶使戊糖磷酸盐循环与氢酶产氢过程相耦合，使产氢达到11.6molmol葡萄糖，充分展现了人工构建代谢途径对于产氢的庞大潜力。但是这一方法目前还只能在体外进行，成本相当高。通过细菌的代谢工程改造和控制，将会是突破暗发酵制氢低转化率的重要突破口。目前已知的发酵制氢的产氢途径包括甲酸途径、丙酮酸途径和NADH途径。其中NADH途径是最具开发潜力的方向，多篇文献中提到提高NADH的含量是有利于产氢的。目前普通的产气肠杆菌产氢量仅为1.58 molH2/mol葡萄糖，但是Tanisho等估量通过加入一种抑制剂使NADH脱氢酶络合物不能形成则NADH的氧化步骤被阻断而FADH2的氧化不受影响，从而使三羧酸循环所产生的NADH用于产氢，从理论上可望实现每摩尔葡萄糖产10 mol氢气8-9。核心问题是如何把细胞代谢过程中产生大量NADH，通过代谢途径的导向直接为氢酶提供还原力进行产氢。现代分子生物学的发展已经可以操作电子呼吸链，因此通过基因工程手段改变代谢途径，从而大大提高产氢效率的妄图是完全有可能实现的。经检索表明，国内外关于在转基因水稻秸杆中表达纤维素酶和半纤维素酶促进其高效水解的相关专利尚未见到，关于在产气肠杆菌中剔除乳酸等不利于产氢的基因片段并且导入产氢酶Fe-hydrogenase基因片段的相关专利也没有见到。日本专利JP2003102482 10报道了从梭菌Clostridium paraputrificum中得到一种具有特别碱基序列的氢化酶基因，将其植入寄主细胞进行基因重组可提高产氢量。日本专利JP62134091 11 将一种在柠檬酸细菌的染色体DNA上表达的氢化酶基因植入普通的DNA单元质粒，从而形成一种混合的DNA质粒能使产氢能力显著提高。欧洲专利WO2006062130 12 在一株含有甲酸盐脱氢酶基因 (formate dehydrogenase gene)和氢化酶基因的菌株内植入一种活性剂基因，从而提高了甲酸的产氢量。美国专利仅有一篇关于改造藻类基因强化其光合作用产氢的报道，中国专利主要集中于氢酶的鉴定和基因测序，美国和中国专利都没有关于发酵产氢细菌基因改造方面的报道。参考文献：1 Gadab C. Ghosh Biswas, Callista R, et al. Expression of biologically active Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in transgenic maize plants. Plant Science, 2006 (In press).2 J. Mishra, N. Kumar, A.K. Ghosh, D. Das. Isolation and molecular characterization of hydrogenase gene from a high rate of hydrogen-producing bacterial strain Enterbacter cloacue IIT-BT 08. International Journal of Hydrogen Energy 27 (2002) 1475 1479.3 Lindblad P, Christensson K, Lindberg P,et al. Photoproduction of H2 by wildtype Anabaena PCC 1720 and a hydrogen uptake deficient mutant; from laboratory to outdoor culture. International Journal of Hydrogen Energy,2002,27:1271-1281. 4 Lu WY. Wen JP. Jia XQ.et al. Effect of He-Ne laser irradiation on hydrogen production by Enterobacter aerogenes. International Journal of Hydrogen Energy (in press).5 郑国香，任南琪，林海龙等. 诱变菌种选育高效产氢菌株. 第六届全国氢能学术会议论文集. 2005；11：137.6 G. Chittibabu, Kaushik Nath, Debabrata Das. Feasibility studies on the fermentative hydrogen production by recombinant Escherichia coli BL-21. Process Biochemistry 41 (2006) 6826887 H Yokoi, T Tokushige, J Hirose, et al. H2 production from starch by a mixed culture of Clostridium butyricum and Enterobacter oerogenes. Biotechnology Letters, 1998, 20: 143-147.8 Tanisho S, Ishiwata Y, Takahashi K. Hydrogen production by fermentation and a trial for improment on the yield of hydrogen, Hydrogen energy Progress. Proceedings of the Ninth World Hydrogen Energy conference. 1992:583-590.9 Tanishio S, in Biohydrogen,ed, O R Zaborsky. Hydrogen production by Facultative Anaerobe Enterobacter aerogenes. Plenum press M. 1998:273-27910 日本专利，Gene, Protein, Recombinant, and Method for Producing Hydrogen，公布号：JP200310248211 日本专利，Novel Hybrid Plasmid and Microorganism Capable of Highly Producing Hydrogen，公布号：JP6213409112 欧洲专利，Microorganism having improved gene participating in hydrogen production ability and method of producing hydrogen by using the microorganism，公布号：WO20060621303.3、课题主要研究内容、拟解决的技术难点和主要创新点，现有研究基础主要研究内容（1）转基因植物秸杆的构建和利用：在水稻中转入纤维素酶和半纤维素酶等基因，在获得高产量稻谷的同时又能获得在加工过程中被自身产生的纤维素酶和半纤维素酶高效水解为还原糖的秸秆。（2）培养挑选高效产氢菌株，研究其发酵产氢的反应动力学，对其进行纯化、分离和鉴定，研究其生理生态学特点以及最佳的代谢反应条件。（3）通过knock out 技术，剔除产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因，抑制产氢细菌在代谢过程中形成乳酸等的有效途径，从而达到加强产氢途径的效应，测定基因改造后产氢细菌的产氢效率和性状。（4）同时通过克隆Fe-hydrogenase基因，在产氢细菌中转入Fe-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平，进一步增强产氢效率。（5）将高效产氢菌Enterobacter aerogenes的产氢酶重组入非产氢抗性菌的基因组，获得耐酸性和其它对环境耐受力强的产氢菌株。（6）研究转基因新型产氢菌的发酵产氢机制及其代谢条件，加入抑制剂提高产氢代谢过程中NADH含量，通过控制代谢途径的导向直接为氢酶提供还原力，以增强其产氢效率。（7）设计高效产氢反应器，研究转基因秸杆的发酵产氢过程，考察pH值、氧化还原电势和温度等参数对产氢过程的影响，优化反应器运行条件。（8）研究转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢量、速率和浓度等，探索实现其最大能源转化率的控制原理。拟解决的技术难点（1）获得转基因水稻种子和植株，在获得高产量稻谷的同时能产生成功表达纤维素酶和半纤维素酶的秸秆。（2）在产氢菌中剔除乳酸等不利于产氢的基因片段，导入产氢酶Fe-hydrogenase基因片段。主要创新点（1）利用转基因植物自身表达的酶达到植物细胞壁的自身降解，省去传统方法中的酸或碱预处理。通过转基因在植物中表达纤维素酶和运用表达纤维素结合蛋白改变纤维素的结构来降低在生物质降解中酶制剂的用量。（2）通过基因剔除和导入，抑制产氢细菌代谢通道中乳酸等不利于产氢的代谢途径，增强产氢酶Fe-hydrogenase的基因表达水平，从而显著提高发酵产氢效率。现有研究基础浙江大学能源清洁利用国家重点实验室在生物质能源化利用方面具有深厚的研究基础，在生物质的能源化高效转化和清洁利用方面取得了突出业绩。申请者程军副教授和刘建忠教授长期从事生物质和化石能源的高效转化和清洁利用研究工作，曾经承担和参加了多项国家及省部级重大科研项目，具有较强的科研工作能力，并积存了丰富的研究体会。在生物质及固体有机废弃物的微生物法产氢研究领域，承担了一项国家自然科学基金项目“城市固体有机废弃物以微生物发酵法联产氢气和甲烷的机理研究”、1项全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目、1项霍英东优选资助基金项目和1项浙江省科技攻关项目。并已取得了一定的研究成果：实验研究了产气肠杆菌在不同固定化条件下的发酵产氢特性；研究了富含碳水化合物、蛋白质和脂肪等三类大分子有机质的废弃食物发酵产氢特性；研究了不同来源的活性污泥对不同方法预处理的稻草秸杆发酵产氢特性的影响规律；研究了以厌氧活性污泥为接种物时各种反应条件对水葫芦发酵产氢的影响规律。提出了一种发酵法联产氢气和甲烷的新工艺，探索了发酵和光合耦合法高效产氢体系，并对秸杆生长细胞和产氢菌株的基因工程改造进行了可行性研究，使系统的能源转化率获得突破性提高。在该领域目前已发表和录用学术论文7篇，其中EI收录1篇，中文重要期刊4篇。1 周俊虎，戚峰，程军等，秸秆发酵产氢的预处理方法研究，太阳能学报，2006（已录用）2 周俊虎，谢琳，程军等，富含三类大分子有机质的废弃食物发酵产氢特性，浙江大学学报（工学版），2006（已录用）3 周俊虎，戚峰，程军等，不同来源的活性污泥对稻草发酵产氢影响的实验研究，浙江大学学报（工学版），2006（已录用）4 周俊虎，戚峰，程军等，秸秆发酵产氢的影响因素研究，环境科学，2006（已录用）5 程军，潘华引，戚峰等，污泥和水葫芦混合发酵产氢的影响因素分析，武汉理工大学学报，2006（已录用）6 程军，周俊虎，谢斌飞等，Biohydrogen production from food waste by anaerobic fermentation. Proceedings of the ASME Power Conference. Chicago, USA, April, 2005: 1433-1436.（EI收录）7 程军，谢琳，谢斌飞等，Biohydrogen production from solid organic wastes by heat-shock digested sludge. Proceedings of the 8th Asian Hydrogen Energy Conference. Beijing China, May, 2005: 13-19.浙江大学农业生物学院分子生物学实验室张传溪教授和鲍艳原副教授长期从事分子生物学和基因工程研究，对多种病毒进行基因组分析，基因表达、调控、删除、蛋白互作等进行了深入的研究，发表了一系列SCI收录文章。在细菌和病毒基因组基因剔除研究方面，建立了高效的ET重组系统和pBAD-gba-A重组系统,并在大肠杆菌中构建了杆状病毒人工染色体，通过ET重组，在大肠杆菌Bacmid中剔除了Bm79, Bm118、Bm9, chitinase等一系列基因。近年来致力于产氢菌株和水稻秸杆的基因工程改造研究，在产气肠杆菌剔除乳酸基因片段方面取得了一定的研究成果。浙江大学种质创新和分子育种平台具有良好的分子育种条件，是“211”和“985”建设平台。目前高标准的水稻、玉米等农作物转基因实验室能够全年产生转基因植物。拥有300平方米的智能温室。本项目组成员李春雨博士后长期从事植物转基因改良农作物的研究和开发，目前参加的国家杰出青年基金和国际合作项目主要研究目标是农作物转基因改良研究，直接与生物质能转化有关的研究包括：1）植物细胞壁降解酶（polygalacturonase and pectinesterase）的分离和克隆；2) 在水稻中通过转基因表达纤维素酶，目前已经获得了成功表达纤维素酶的转基因水稻苗。因此，本课题组对于产氢细菌和水稻秸杆的基因改造研究具有深厚的专业理论背景和扎实的研究实践体会。3.4、课题预期达到的目标、主要技术指标，可获得专利等知识产权及人才培养情形预期目标构建能表达纤维素酶和半纤维素酶的转基因水稻，获得能被自身植株生长产生的酶高效水解为还原糖的秸秆。挑选培养高效产氢菌株，通过knock out 技术，剔除产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因，抑制产氢细菌在代谢过程中形成乳酸等的有效途径；同时通过克隆Fe-hydrogenase基因，在产氢细菌中转入Fe-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平。提高产氢菌的耐酸性等对环境耐受力，提高产氢代谢过程中NADH含量，从而显著提高发酵产氢效率。设计出高效产氢反应器并优化其运行条件，使转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢能力和能源转化率获得突破性提高。主要技术指标1、 在水稻等种子和植株茎杆中成功表达纤维素酶等高效降解酶的基因，获得能够在加热到90左右环境中自身高效水解的转基因秸杆，从而省掉成本高而且污染大的酸碱预处理，并且在水解过程中能够减少外加纤维素酶制剂的用量50%以上。2、 在产气肠杆菌的基因组中通过基因剔除和导入，抑制产氢细菌代谢通道中乳酸等不利于产氢的代谢途径，增强产氢酶Fe-hydrogenase的基因表达水平，从而获得高效的转基因产气肠杆菌，发酵产氢量提高到3 molH2/mol葡萄糖以上，产氢效率提高50%以上。知识产权 拟申请国家发明专利2项。人才培养 拟培养1名青年骨干教师列入教育部新世纪人才或省级151人才以上计划；拟培养博士研究生4名，硕士研究生4名。3.5、课题拟采取的研究方法，课题技术路线（或实施方案）及其可行性分析（如有协作单位，请说明课题的任务分工）研究方法和技术路线（1） 通过转基因改变植物纤维素的结构。在植物中表达荧光蛋白质与纤维素结合蛋白的融合蛋白质，使其与纤维素结合，从而使秸秆中的纤维结构发生变化。因融合蛋白质的存在改变了纤维素与纤维素的结合关系，从而为纤维素的酶降解提供了切入点。在植物中表达抗高温纤维素酶和半纤维素酶，表达了这些酶的农作物秸秆在收成过程中或者其后经过高温（90左右）处理，实现对纤维素和半纤维素高效水解成直接可供产氢菌利用的小分子还原糖，从而为秸秆的高效转化提供更好的起始材料。（2） 挑选培养高效产氢菌株，进行纯化、分离和鉴定。通过分子生物学中应用成熟的细菌ET重组修饰系统，转入产氢细菌，构建可重组产氢细菌。克隆产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因及其侧翼序列，以CAT为报告基因，构建基因重组片段。利用knock out 等技术，剔除产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因，抑制产氢细菌在代谢过程中形成乳酸等的途径，从而达到加强产氢途径的效应。（3） 克隆Fe-hydrogenase基因，通过ET系统在产氢细菌中转入Fe-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平，进一步增强产氢效率。通过CAT抗性标记，挑选重组的产氢细菌，通过系列PCR，鉴定ldh被剔除的产氢细菌并转入Fe-hydrogenase，测定基因改造后产氢细菌的产氢效率和性状。（4） 将高效产氢菌Enterobacter aerogenes的产氢酶重组入非产氢抗性菌的基因组，获得耐酸性和其它对环境耐受力强的产氢菌株。研究转基因新型产氢菌的发酵产氢机制及其代谢条件，加入抑制剂提高产氢代谢过程中NADH含量，通过控制代谢途径的导向直接为氢酶提供还原力，以增强其产氢效率。（5） 设计高效产氢反应器，研究转基因秸杆水解产物的发酵产氢代谢过程，及时抽取发酵气，以防止氢分压过高对酸化过程造成抑制作用。对各个阶段产氢反应器的终端气相和液相产物定期取样，送入气相色谱仪和色质联机分析成分，考察pH值、氧化还原电势和温度等参数对产氢过程的影响，优化反应器运行条件。研究转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢量、速率和浓度等，探索实现其最大能源转化率的控制原理。可行性分析 目前美国麻省理工学院、密歇根州立大学、加州大学Davis分校、杜邦公司和Syngenta公司等正在加紧研究在玉米、甘蔗等植株中表达纤维素酶和半纤维素酶，以获得更有利于秸秆高效水解糖化的农作物。2006年秋即将出版的国际期刊Plant Science报道了密歇根州立大学的最新研究成果，将纤维素酶通过电击转入玉米中得到转基因植株，在叶片的总可溶性蛋白质中纤维素酶含量达到2.1%，而在根系中含量达2.08%。本课题组长期致力于农作物转基因改良研究，对在水稻中通过转基因表达纤维素酶进行了多年富有成效的研究，承担了相关的国家杰出青年基金和国际合作项目，目前已经成功获得表达了纤维素酶的转基因水稻苗。目前通过基因工程改造产氢菌和氢酶已成为在微生物制氢研究领域国际上最新的热点课题，已引起许多研究机构的高度重视并成为技术竞争的制高点之一。本课题组长期从事分子生物学和基因工程研究，对多种细菌进行基因组分析，基因表达、调控、删除、蛋白互作等进行了深入的研究。建立了高效的ET重组系统和pBAD-gba-A重组系统，并在大肠杆菌中构建了杆状病毒人工染色体，通过ET重组，在大肠杆菌Bacmid中剔除了Bm79, Bm118、Bm9, chitinase等一系列基因。近年来致力于产氢菌株的基因工程改造研究并取得了一定成果。本项目提出通过ET重组修饰系统剔除产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因，同时在产氢细菌中转入Fe-hydrogenase基因增强产氢酶表达水平，从而显著提高发酵产氢效率。项目研究目标明确，技术路线合理，实验方案可行，关于该项目基因工程改造所涉及的关键技术本课题组已完全把握，因此能够顺利完成研究任务，实现研究目标。构建进行生物质能转化的相关基因在水稻中表达载体。（包括纤维素结合蛋白质，纤维素酶等基因）产生转基因植物，检测转入基因在水稻中的表达水平和生物化学活性。利用转基因作物作为生物质材料研究微生物产氢的转化能力。并与非转基因作物比较，研究转化效率和转化成本的差异。繁育转基因水稻，获得转基因秸秆克隆产氢细菌Enterobacter aerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因及其侧翼序列，以CAT为报告基因，构建基因重组片段将含rec, rec, rec的ET重组系统转入产氢细菌，构建可重组产氢细菌。