2022年2022年酵母转化 .pdf
酵母转化( 一)原理：我们采用的是PEG/ LiAc 法转化酵母。PEG 是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的 PEG 才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG 分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达到 103105cfu/g 。 PEG 在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG 的浓度是务必适宜,这一点很重要。LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。鲑鱼精担体DNA为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解 ;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开 ,保证鲑鱼精担体DNA 在转化实验体系中以单链形式存在( 二)材料、仪器设备及试剂：1.SD 培养基：YNB ：1.6 g/L 硫酸铵： 5g/L 氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加调节 pH=5.8，121灭菌 15min 2.YPDA 培养基胰蛋白胨20g/L 酵母浸膏10g/L 琼脂20g/L( 固体 ) 腺嘌呤15ml 0.2% 腺嘌呤 / L 调节 pH =7.5， 121灭菌 15min 3.0.9%NaCl（w/v ）NaCl: 0.9g milipore 水定容到 100ml 灭菌 121， 20min 4.100%DMSO 从试剂瓶中分装到ep 管中， 500ul 每管，室温保存5.10TE（pH=7.5） ：（0.1M Tris-HCl ，10mM EDTA ）Tris-HCl 1.211g/100ml EDTA 0.37g/100ml 调节 pH=7.5, 121 ， 20min 6.10LiAc （pH=7.5 ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 1M LiAc10.202g/100ml 用醋酸调节pH=7.5，121灭菌 20min 7.1.1TE/LiAc Tris-HCl 11ml 10 LiAc （pH=7.5 ）/100ml EDTA 11ml 10 EDTA （pH=7.5）/100ml 调节 pH=7.5, 121 ， 20min 8.50% PEG3350：PEG3350：50g 已灭菌的milipore 水：定容到 100m （可用 50水浴助溶，PEG 易吸水，不可灭菌）9.PEG/LiAc ：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep 管或 50ml 离心管中终浓度10ml PEG3350 40% 8ml 50%PEG3350 TE buffer 11ml 10 TE LiAc11ml 10LiAc10.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml) 11.milipore 水， 70%酒精棉球， 50ml 离心管4 个， ep 管一盒， 15ml 试管架， 50ml 试管架， ep 管架( 三)具体方法：A：酵母感受态制备1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA 平板上划单克隆，30培养 3 天左右。2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA 的玻璃试管中（平行做3管）3.30， 250rpm，培养 8-12h 4.取 200ul 菌液，测OD600 5.选取 OD600 值最大的一个试管 （即活力最高的一个） ， 吸取 5ul 转移至 50m 新鲜的 YPDA培养基中（培养基装在250ml 三角瓶中）6.30， 230rpm，培养 16-20h，直至 OD600=0.15-0.3 7.将培养好的菌液转入2 个 50ml 离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml 新鲜的 YPDA 悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。8.30， 230rpm 培养直到OD600=0.4-0.5 （3-5 小时）9.将菌液倒入2 个 50ml 离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml milipore 水重悬。10.再次离心， 3000g，3min，弃上清，每管用1.4ml 1.1 TE/LiAc 重悬。11.将重悬的菌液转移到2 个 ep管中， 12000rpm，15s 12.弃上清， 每管用 600ul 1.1TE/LiAc 重悬， 将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。B：酵母质粒转化小规模转化大规模转化1.加入质粒DNA 100-500ng 3-5ug 鲑鱼精 DNA( 变性的， 10mg/ml) 5ul 20ul 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 加入感受态细胞, 轻弹混匀50ul 600ul 2.加入 PEG/LiAc, 轻弹混匀500ul 2.5ml 3.30水浴，每10-15min 轻弹混匀30min 45min 4.加入 DMSO, 轻弹混匀20ul 160ul 5.42水浴，每5-10min 轻弹混匀15min 20min 6.离心，弃上清最大转速3000g 15s 3min 7.用液体 YPDA 培养基重悬1ml 3ml 8.30， 230rpm，培养90min 90min 9.离心，弃上清最大转速3000g 15s 3min 10.用 0.9%NaCl 重悬1ml 15ml 11.涂板在相应的筛选培养基上。( 四)注意事项：1.转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一般制备酵母感受态的细胞必须是没有经过4保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。2.在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD 值， 要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，特别是最后一次培养，OD600 的值不要超过0.5 3.酵母转化过程中，没有抗生素， 极易染菌， 所有实验都在超净台中进行，超净台需提前一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作时，需用70%酒精棉擦手消毒。4.由于酵母生长周期较长，平板一般在培养箱中要放3 天左右， 所以在倒板时， 不可吹得太干，小板晾干10min 左右，大板晾干15min 左右即可5.有些筛选培养基需要加入3-AT，必须是在培养基冷却到55一下才可加入。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -
